韓 梅， 彭 帥， 依艷麗

（沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院，沈陽 110866）

玉蜀黍平臍蠕孢拮抗細菌YB01的鑒定及拮抗作用

韓 梅， 彭 帥， 依艷麗＊

（沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院，沈陽 110866）

通過形態(tài)特征、生理生化及16SrDNA同源性序列分析對玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）拮抗細菌YB01進行鑒定，結果表明，該菌為蒼白桿菌屬的一種（Ochrobactrumsp.），序列號為HQ141339。YB01對玉蜀黍平臍蠕孢的拮抗作用研究表明：YB01培養(yǎng)液可以有效抑制玉蜀黍平臍蠕孢的生長、孢子的形成與萌發(fā)。顯微鏡觀察結果表明，用YB01培養(yǎng)液處理的玉蜀黍平臍蠕孢菌絲體膨大變形，細胞質發(fā)生濃縮，表明YB01的拮抗作用主要是通過其代謝產(chǎn)物影響玉蜀黍平臍蠕孢細胞壁而實現(xiàn)的。

玉蜀黍平臍蠕孢； 鑒定； 拮抗作用； 代謝產(chǎn)物

植物病害是制約農作物產(chǎn)量、降低農作物品質的一個重要因素?；瘜W農藥是當前防治植物病蟲害的重要手段，但化學農藥的使用不僅會造成環(huán)境污染，還會使植物病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，要減少化學農藥的用量，開發(fā)和研制高效安全的生物防治技術，將是植物病害防治的趨勢。植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物對農作物病害進行有效的防治技術與方法［1］。其主要作用機制是通過拮抗微生物分泌的各種代謝產(chǎn)物，如蛋白酶［2］、幾丁質酶［3］、嗜鐵素［4］和多種抗生素［5］等物質，對植物病原菌產(chǎn)生強烈的抑制作用。

玉米是我國主要的大田作物之一。玉米小斑病是一種由玉蜀黍平臍蠕孢引起的較嚴重的玉米葉部病害。20世紀70年代，美國因大面積種植帶有T型雄性不育細胞質的玉米雜交種，造成玉米小斑病大流行，產(chǎn)量損失達165億kg［6］。本研究對自主分離的一株玉蜀黍平臍蠕孢的拮抗細菌YB01進行了常規(guī)和16SrDNA鑒定，并研究其培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲生長、菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)的影響，為玉米小斑病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

玉米小斑病病原菌，由沈陽農業(yè)大學微生物研究室保藏。

細菌YB01：對玉蜀黍平臍蠕孢具有較好的拮抗作用，由沈陽農業(yè)大學微生物研究室分離和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌YB01的鑒定

（1）16SrDNA序列分析：采用細菌16SrDNA擴增的通用引物fD1和rP，正向引物fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反 向 引 物 rP：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。模 板 DNA運用EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取。PCR擴增在50μL反應體系中進行。擴增條件：94℃變性5min后進行35個循環(huán)（94℃1min，55℃1min，72℃1min），然后72℃充分延伸10min，最后4℃保存。取5μL的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢查。確定有1 500bp左右產(chǎn)物之后，將PCR產(chǎn)物純化后送交上海生工生物技術服務有限公司測序。最后將測序結果在NCBI上使用Blast程序進行同源性比對分析，向GenBank提交序列，并用Mega4.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（2）生理生化鑒定：參考文獻［7］和［8］的方法對YB01進行碳源利用試驗。

1.2.2 YB01對病原真菌菌絲的抑制作用測定

采用菌落生長法［9］略作改動。挑取菌株YB01接種到裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、150r／min培養(yǎng)48h后，離心，用0.22μm濾膜過濾，制成無菌培養(yǎng)液，然后再將無菌培養(yǎng)液用無菌水稀釋成濃度為75%、50%和25%的無菌培養(yǎng)液。分別取濃度為100%、75%、50%和25%的無菌培養(yǎng)液10mL與融化的50℃的90mL PDA培養(yǎng)基混勻，立即倒平板，制成含有10%、7.5%、5%和2.5%無菌培養(yǎng)液的固體培養(yǎng)基平板，取直徑為5mm的病原菌菌塊放于培養(yǎng)基平板中央，以相同體積的無菌水PDA培養(yǎng)基為對照，重復處理3次，置于28℃下培養(yǎng)7d，每24h用十字交叉法測量菌落直徑。采用以下公式計算培養(yǎng)7d時的抑菌率：

1.2.3 YB01對病原真菌孢子形成的影響

將上述培養(yǎng)7d的病原菌菌落用打孔器在菌落生長邊緣2～3mm打取5mm的菌塊，放入裝有5mL滅菌水的試管中，將孢子洗脫后，用血球計數(shù)板計數(shù)，每個平板取3塊，計數(shù)3次，最后得到的平均數(shù)為孢子數(shù)。采用以下公式計算產(chǎn)孢抑制率：

1.2.4 YB01對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

用打孔器在病原菌菌落上打取直徑5mm的菌塊，放入裝有滅菌水的試管中，將孢子洗脫后，制成孢子懸浮液并調節(jié)濃度至3×108個／mL。采用懸滴法［8］，取孢子懸浮液50μL與等量的無菌培養(yǎng)液置凹玻片中混勻，以無菌水配制的孢子懸浮液作對照，28℃保濕培養(yǎng)6h，每隔1h觀察孢子萌發(fā)情況并計算孢子萌發(fā)率。

1.2.5 YB01對病原菌菌絲形態(tài)的影響

對病原菌菌絲形態(tài)的影響采用懸滴法，將在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的病原菌菌絲置于加有100μL無菌培養(yǎng)液中的凹玻片中28℃保濕培養(yǎng)。以浸于無菌水的病原菌菌絲作為對照。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)12h和24h時病原菌菌絲形態(tài)的變化。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌YB01的鑒定

表1為拮抗細菌菌株YB01的生理生化鑒定結果。菌株的測序由上海生工生物技術服務有限公司完成，所獲得的片段大小為1 441bp，通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST軟件進行對比，結合生理生化特征確定為蒼白桿菌屬的一種（Ochrobactrumsp.），將序列提交到GenBank，獲得的序列號為 HQ141339。圖1為YB01的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 菌株YB01的生理生化特征1）

圖1 基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 YB01對病原真菌菌絲的抑制作用

運用菌落生長法測定不同濃度無菌培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢的菌絲抑制作用，結果見圖2。從結果可以看出不同濃度的培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢的菌絲生長均有一定的抑制作用，所含培養(yǎng)液的濃度越高，抑制效果越明顯。其中在含培養(yǎng)液濃度為10%的PDA平板上病原真菌的生長擴張最緩慢，培養(yǎng)7d后菌落直徑為21mm，抑菌率達到76.4%（表2）。以上結果說明YB01對玉蜀黍平臍蠕孢的抑制作用很可能與其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有關。

圖2 不同濃度YB01培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲生長的影響

2.3 YB01對病原真菌孢子形成的影響

不同濃度的YB01培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢孢子的形成均有影響（表2）。由結果可知，10%的培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢的產(chǎn)孢抑制率達到了55.2%，這說明YB01產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不僅可以抑制玉蜀黍平臍蠕孢菌絲的生長還對其孢子產(chǎn)生有很好的抑制效果。

表2 YB01對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲生長和孢子形成的影響1）

2.4 YB01對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

YB01對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用結果見圖2。由結果可知對照組孢子在培養(yǎng)3h時萌發(fā)率達到了100%，而用YB01培養(yǎng)液處理的孢子在培養(yǎng)3h時萌發(fā)率僅為22%，6h為57%，說明YB01培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。

圖3 YB01對玉蜀黍平臍蠕孢孢子萌發(fā)的影響

2.5 YB01對病原菌菌絲形態(tài)的影響

用YB01培養(yǎng)液處理玉蜀黍平臍蠕孢后用光學顯微鏡觀察菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)12h時，玉蜀黍平臍蠕孢部分菌絲出現(xiàn)膨大，局部呈瘤形，泡囊狀，細胞質濃縮（圖4b）。培養(yǎng)24h時，大部分菌絲出現(xiàn)膨大，形態(tài)出現(xiàn)瘤形畸形（圖4d）。由以上結果可以得出，玉蜀黍平臍蠕孢菌絲形態(tài)的變化與培養(yǎng)液中的YB01某些代謝物有關，這種代謝產(chǎn)物能夠破壞玉蜀黍平臍蠕孢細胞壁結構，或者影響細胞壁合成，從而改變了細胞正常的滲透壓，進而發(fā)生膨大變成泡囊狀。

圖4 YB01培養(yǎng)液對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲形態(tài)的影響

3 結論與討論

生物防治是一種有效的植物病害防治措施，目前國內外的研究主要集中在生物源的發(fā)掘和拮抗物質的探索等方面。本研究鑒定了對玉米小斑病病原菌玉蜀黍平臍蠕孢具有拮抗作用的細菌YB01，并詳細研究了YB01對玉蜀黍平臍蠕孢的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)YB01的代謝產(chǎn)物對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲生長、孢子形成和萌發(fā)具有抑制作用。

在觀察YB01代謝產(chǎn)物對玉蜀黍平臍蠕孢菌絲形態(tài)的影響時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過培養(yǎng)液處理的菌絲發(fā)生膨大和泡囊狀變化，由此可以推斷出YB01的某些代謝產(chǎn)物破壞玉蜀黍平臍蠕孢細胞壁結構，或者影響了細胞壁合成，從而改變了細胞的通透性。邢介帥等［2］在研究產(chǎn)蛋白酶生防細菌對病原真菌的拮抗作用時發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶可以使棉花枯萎病菌菌絲發(fā)生串珠狀膨大出現(xiàn)細胞破裂、細胞質外滲等現(xiàn)象，這也與本研究所得結果相似。此外，一些生防細菌還可以產(chǎn)生幾丁質酶、1，3-葡聚糖酶等水解酶，裂解病原真菌的細胞壁，從而抑制病原真菌的生長［3，10－11］。

目前還未見蒼白桿菌產(chǎn)生抗生素類物質的報道，但研究發(fā)現(xiàn)一些植物的內生拮抗細菌中包括蒼白桿菌［12］。因此為了進一步研究YB01對病原真菌的拮抗作用，在分離純化抑菌代謝物的基礎上，分析其化學性質和結構，并利用高純度的抗菌物質作用于細胞結構，得出完整的抑菌機理，為YB01應用于生物防治提供理論依據(jù)。

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Identification of the antagonistic bacterium YB01 againstBipolaris maydisand its antagonism

Han Mei， Peng Shuai， Yi Yanli
（College of Land and Environment Sciences，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China）

The antagonistic bacterium YB01 was identified by the characteristics of morphology，physiology，biochemical tests and sequence analysis of 16S rDNA，which was identified asOchrobactrumsp.The antifungal mechanism of the YB01 was investigated in this study.The results indicated that mycelial growth，spore formation and germination ofBipolaris maydiscould be inhibited by the metabolites.The mycelia affected by the metabolites also showed surface nodulation and protoplasmic condensation.It is speculated that the metabolites may target at the fungal cell walls.

Bipolaris maydis； identification； antagonism； metabolite

S 482.292

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.029

2010-09-03

2010-09-28

遼寧省設施蔬菜產(chǎn)業(yè)項目；遼寧綠豐農業(yè)技術開發(fā)中心合作項目（4130206-1103-01064508002）

＊ 通信作者 E-mail：yiyanli＠163.com