畢 武， 陳 娟， 焦曉林， 高微微

（中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193）

北京地區(qū)西洋參根腐病病原鑒定及其致病性

畢 武， 陳 娟， 焦曉林， 高微微＊

（中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193）

根腐病是北京地區(qū)栽培西洋參的主要病害之一，為了明確引起該類病害的病原菌，對北京懷柔區(qū)罹病西洋參參根進行了病原菌的分離及鑒定。結(jié)合形態(tài)學以及rDNA ITS區(qū)、轉(zhuǎn)錄延伸因子TEF-1α區(qū)的分子序列特征，對分離菌株的鑒定結(jié)果顯示，分離頻率較高的11個菌株分屬于茄鐮孢（Fusarium solani）、尖鐮孢（F.oxysporum）、三線鐮孢（F.tricinctum）、多育鐮孢（F.proliferatum）、毀滅柱孢（Cylindrocarpon destructans）。通過柯赫氏法則驗證，F(xiàn).solani和F.oxysporum是引起北京地區(qū)栽培西洋參根腐病的主要病原菌；致病性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)F.solani不同菌株的致病性及致病力表現(xiàn)出明顯差異。

西洋參； 根腐病； 鐮刀菌； 致病性

西洋參（Panax quinquefoliumLinn.）又名花旗參、美國人參，為多年生五加科草本植物，原產(chǎn)于北美洲，作為珍貴的滋補藥在我國已有200多年的應用歷史，中醫(yī)用于治療氣虛陰虧，血熱，咳喘痰血，虛熱煩倦，口燥咽干等病癥。20世紀80年代，西洋參在我國東北、華北地區(qū)引種成功。經(jīng)過20多年的發(fā)展，北京懷柔區(qū)已成為我國西洋參的主產(chǎn)區(qū)之一，西洋參種植成為當?shù)剞r(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。然而隨著種植年限的增加，病害問題日益突出，嚴重影響了西洋參的產(chǎn)量和質(zhì)量。筆者在2005－2009年期間對北京市懷柔區(qū)西洋參根病進行了調(diào)查，在西洋參栽培種植的4年當中，根腐病均有發(fā)生，以1年生和4年生參根發(fā)病較為普遍，收獲時西洋參根腐病的發(fā)生率在20%～80%。主要癥狀表現(xiàn)為褐色干腐，發(fā)病初期根表面出現(xiàn)不規(guī)則黃褐色病斑，隨著病情發(fā)展，病斑逐漸擴大，嚴重時須根消失，整個參根表面全部變?yōu)楹稚?，病斑逐漸向根內(nèi)部發(fā)展。關(guān)于引起西洋參根腐病的病原，國內(nèi)外報道主要包括鐮刀菌屬的Fusarium solani、F.oxysporum、F.dlamini及柱孢屬的Cylindrocarpon panacicola、C.destructans等，不同地區(qū)根腐病的癥狀類似，但主要致病菌存在差異［1－4］。王麗華等報道［5］北京地區(qū)西洋參根腐病病原菌為Fusariumsp.，但沒有鑒定到種。為此，作者對北京地區(qū)西洋參根腐病病原菌進行了分離鑒定，并對不同菌株的致病力進行比較，以期為根病的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和純化

1～4年生西洋參病根樣品分別于2006年8月和10月采自北京市懷柔區(qū)趙各莊、七道河及湯河口等種植基地，采用組織分離法進行致病菌分離，分離到的菌株經(jīng)單孢純化后接種在PDA斜面上，4℃冰箱中保存。

1.2 菌株的致病性測定

采用活體參根接種法。將所保存的待測菌株接種到PDA平板上活化，25℃下培養(yǎng)7d后，用無菌蒸餾水洗下孢子，并將孢子濃度調(diào)整到1×106個／mL。取冬季休眠期健康2年生西洋參完整參根，用5%NaClO進行表面消毒，無菌水沖洗3次，然后在配好的孢子懸浮液中浸泡5min，取出放入鋪有2層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水保濕，以無菌水作為對照，每個菌株接種12棵參根，其中6根為刺傷接種。25℃黑暗條件下培養(yǎng)。接種期間西洋參根為活體狀態(tài)。對接種后表現(xiàn)根腐癥狀的參根進行病原再次分離培養(yǎng)，觀察得到的病菌是否與原接種菌株相同。試驗于第2年重復1次。

1.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

將供試菌株接種到PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL）平板上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)10d后，觀察菌株的菌落特征、分生孢子和產(chǎn)孢細胞形態(tài)，并測量分生孢子的大小。根據(jù)菌株的產(chǎn)孢表型及其在PSA培養(yǎng)基上的菌落特征，參考 Booth C 和John F.Leslie等［6－8］的著作對鐮刀菌屬菌株進行鑒定。

1.4 病原菌的分子鑒定

1.4.1 基因組DNA的提取

將保存的菌株在PDA平板上活化后，接種到裝有100mL PDB培養(yǎng)液（馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1 000mL）的250mL三角瓶中，25℃黑暗靜置培養(yǎng)，7d后收集菌絲。采用E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit（Omega Bio-tek.Inc）提取和純化基因組DNA。

1.4.2 擴增引物

rDNA ITS區(qū)采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4 （5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）進行 PCR 擴增；轉(zhuǎn)錄延伸因子TEF-1α區(qū)采用通用引物 EF1T（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′）和 EF2T（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）進行PCR擴增。

1.4.3 PCR 反應條件［9－10］

PCR反應體系為：10×PCR buffer 5μL，25mmoL MgC125μL，10mmoL dNTP 2μL，5U／μLTaq酶0.4μL（以上試劑均為TaKaRa公司生產(chǎn)），模板DNA 10ng，引物（25mmoL）各1μL，加ddH2O使總體積達到50μL，在PCR擴增儀（PTC-200）上進行擴增。ITS區(qū)擴增條件：95℃ 預變性4min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；轉(zhuǎn)錄延伸因子1α區(qū)的擴增條件：94℃ 預變性1min 25s，95℃變性35s，57℃退火55s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物采用純化試劑盒（中科瑞泰公司生產(chǎn)）進行純化，純化產(chǎn)物由北京奧科生物公司進行序列測定。

1.4.4 序列分析與數(shù)據(jù)處理

測定的rDNA-ITS序列和 TEF-1α序列通過BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／）中的相關(guān)序列進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測定結(jié)果

將不同栽培地點不同參齡的西洋參根腐病病根中分離頻率較高的11株真菌，回接到健康西洋參根上進行柯赫氏法則驗證，并比較其致病性差異。其中8株真菌對西洋參具有不同程度的致病性（表1）。F19、C01菌株無論是無傷接種還是針刺接種的參根都在3d后開始發(fā)病，第5天參根發(fā)病率達到100%，第7天后參根開始腐爛，長滿菌絲，為強致病菌。A06、B11、C03菌株接種后第5天，部分接種的參根開始發(fā)病，傷口處變暗紅褐色并開始腐爛，除芽苞處菌絲較多外，傷口及參根上菌絲稀少，為弱致病菌。B08、TF1、E20菌株只有針刺接種才表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，參根變褐色，腐爛，在無傷接種時不表現(xiàn)癥狀，為條件致病菌。A04、E05、E13菌株無論無傷接種還是針刺接種均不表現(xiàn)病癥，為非致病菌。

表1 病參分離菌的致病性測定

2.2 分離菌株的形態(tài)學及分子鑒定結(jié)果

通過觀察菌落培養(yǎng)性狀、分生孢子形態(tài)以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，對11株分離菌進行了初步鑒定，其中大部分為鐮刀菌。在鐮刀菌中，菌株C03、E20、TF1、F19的形態(tài)學特征符合F.solani種的特征，但其他菌株不產(chǎn)孢或難以觀察到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，因此，采用rDNA ITS及TEF-1α的核苷酸序列對各菌株同時進行了分子鑒定（表2）。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，rDNA ITS序列僅能對部分菌株給出一致的比對結(jié)果，其他菌株（B11、E20及F19）與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中相關(guān)F.solani、F.oxysporum序列的同源性均可達到99%。繼續(xù)采用TEF-1α序列對這些菌株進行驗證，結(jié)果表明這些菌株的TEF-1α序列與F.solani序列的同源性可達到100%，而與F.oxysporum序列的同源性較低。綜合形態(tài)學以及分子比對的結(jié)果，最終鑒定11株菌株分別屬于Fusarium和Cylindrocarpon屬。Fusarium屬中包括茄鐮孢（F.solani）7株，尖鐮孢（F.oxysporum）、三線鐮孢（F.tricinctum）、多育鐮孢（F.proliferatum）各1株，另外1株為毀滅柱孢（Cylindrocarpon destructans）。

表2 11株分離菌株的鑒定結(jié)果

值得關(guān)注的是7株Fusarium solani對西洋參的致病性及致病力表現(xiàn)出明顯差異，包括不能造成侵染的A04；只能從傷口侵染的E20和TF1；造成部分侵染的A06、B11、C03；以及100%侵染的F19。以上結(jié)果表明北京地區(qū)西洋參根腐病主要由F.solani和F.oxysporum引起，而田間F.solani菌株存在致病性分化現(xiàn)象。Cylindrocarpon destructans可能不是北京地區(qū)西洋參根腐病的主要致病菌。

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)對于西洋參根腐病病原的研究已有報道，但不同研究者報道的結(jié)果并不一致［1－2］。一般認為表現(xiàn)為銹腐癥狀的主要由柱孢屬真菌引起，而黑腐癥狀的為鐮刀菌引起，但這兩種癥狀比較接近，往往難以區(qū)分。北京地區(qū)的根腐病癥狀發(fā)病初期為黃褐色，接近銹腐，而后期為深褐色，病根分離菌以鐮刀菌為主，柱孢屬極少，回接能夠直接侵染西洋參完整根的為Fusarium solani和F.oxysporum，這與王麗華等［5］報道北京地區(qū)西洋參根腐病由鐮刀菌（Fusariumsp.）引起的結(jié)果一致。

鐮刀菌在自然界中分布極為廣泛，由于不同種之間形態(tài)相近，同一個種往往出現(xiàn)產(chǎn)不同色素的情況，使鐮刀菌成為真菌中最難鑒定的屬之一。1989年，Guadet等［9］將分子系統(tǒng)學方法應用于鐮刀菌屬種的鑒定。目前用于該屬系統(tǒng)學研究的主要基因包括：β-tubulin；mtSSU rDNA、28SrDNA、ITS、TEF-lα、IGS 等［9－10］。Geiser等［11］建 立 了 基 于 轉(zhuǎn) 錄 延 伸因子1α（TEF-lα）序列的鐮刀菌序列數(shù)據(jù)庫，TEF-lα目前被認為是鐮刀菌分子鑒定較好的標記。本文菌株的形態(tài)及培養(yǎng)性狀的鑒定特征主要采用Booth鑒定系統(tǒng)［6］。在本文分離的菌株中，有些在PSA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，而B11、F19和E20菌株采用ITS方法出現(xiàn)與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中F.solani、F.oxysporum部分菌株序列的同源性均達到99%的情況，而TEF-1α則給出一致的結(jié)果。采用形態(tài)學結(jié)合ITS和TEF-1α2種分子標記結(jié)果對分離的菌株進行鑒定，保證了鑒定結(jié)果的準確性。

F.solani在西洋參病根中分離頻率最高，人工接種試驗表明，F(xiàn).solani的不同菌株在致病性及致病力上表現(xiàn)出明顯差異，在培養(yǎng)性狀上也不同。鐮刀菌屬的致病性在種內(nèi)也存在著差異，國內(nèi)外報道以F.oxysporum研究較多也較深入［12］，王曉靜等［13］報道亞麻枯萎病病原菌F.oxysporum不同菌株間的致病力不盡相同，絕大部分菌株的病情指數(shù)集中在20～50區(qū)間段。致病性及非致病性的F.oxysporum在形態(tài)上難以區(qū)分，但是能夠通過RAPD，AFLP 的手段區(qū)分 開 來［14－15］。非 致 病F.oxysporum在鐮刀菌枯萎病中具有生物防治的潛力［16－17］。從西洋參根腐病病根中分離的非致病F.solani菌株可考慮作為根腐病生物防治的候選菌株，但其生理特性及遺傳穩(wěn)定性尚待進一步研究。

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Identification of the pathogens causing the root rot and their pathogenicity on American ginseng in Beijing

Bi Wu， Chen Juan， Jiao Xiaolin， Gao Weiwei
（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing100193，China）

Root rot is the main disease of cultivated American ginseng in Beijing.Samples of American ginseng rot root were collected from different commercial fields of American ginseng in Beijing for pathogen isolation.Eleven isolates were obtained，among whichFusarium solaniwas the most frequently detected.The pathogenicity of these isolates was tested and the results showed thatF.solaniandF.oxysporumwere highly pathogenic species，and 3isolates ofF.solaniwere weakly pathogenic，whileF.tricinctum，F(xiàn).proliferatumand1isolate ofF.solaniwere non-pathogenic towards American ginseng root.Cylindrocarpon destructansand 2 isolates ofF.solanionly infected the wound roots.These data suggested that there might be pathogenicity differentiation inF.solanitowards American ginseng roots in Beijing.

Panax quinquefolium； root rot；Fusariumspp.； pathogenicity

S 435.675

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.025

2010-10-21

2010-12-28

北京市自然科學基金項目（6072025）；國家自然科學基金項目（30873380）

＊ 通信作者 Tel：010-62899737；E-mail：wwgao＠implad.ac.cn