郭立新， 段維軍， 顧建鋒， 聞偉剛， 黃海泉

（1.北侖出入境檢驗檢疫局，寧波 315800； 2.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012）

木質(zhì)包裝中松材線蟲的實時熒光PCR檢測

郭立新1， 段維軍2＊， 顧建鋒2， 聞偉剛2， 黃海泉1

（1.北侖出入境檢驗檢疫局，寧波 315800； 2.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012）

松材線蟲是進(jìn)境木質(zhì)包裝中的重要檢疫對象之一。本研究以進(jìn)境木質(zhì)包裝中截獲的12種傘滑刃屬線蟲，包括4種不同來源的松材線蟲、3種不同來源的擬松材線蟲、豆傘滑刃線蟲、大尖尾傘滑刃線蟲、阿蘇里傘滑刃線蟲、伯氏傘滑刃線蟲及擬小刺傘滑刃線蟲為材料，進(jìn)行實時熒光PCR檢測。結(jié)果顯示，僅松材線蟲可觀察到明顯的熒光強度變化，而其他線蟲的熒光強度沒有變化。通過研磨樣品的方法，提取單條松材線蟲的DNA，進(jìn)行實時熒光PCR試驗，檢測成功率為100%，且不論是雄蟲、雌蟲或幼蟲均能檢測出來。該研究對于我國口岸進(jìn)境木質(zhì)包裝中松材線蟲的檢測具有一定的實際意義。

木質(zhì)包裝； 松材線蟲； 實時熒光PCR； 檢測

由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松樹萎蔫病是松樹上的重要病害［1］。目前，美國［2］、加 拿 大［3］、墨 西 哥［4］、日 本［5－6］、韓 國［7］、葡 萄牙［8］等國家，以及我國臺灣［9］、南京［10］等地區(qū)均有松材線蟲發(fā)生的報道。為了保護本國林業(yè)，許多國家已將松材線蟲列為檢疫性對象［11－12］，我國也不例外。

隨著國際貿(mào)易日益頻繁，我國進(jìn)境木質(zhì)包裝一直呈增長態(tài)勢，這對木質(zhì)包裝中松材線蟲的檢測提出了更高要求，由于松材線蟲與擬松材線蟲（B.mucrona

tus）、豆傘滑刃線蟲（B.doui）、大尖尾傘滑刃線蟲（B.macromucronatus）等近緣種之間的形態(tài)學(xué)特征存在重疊及變異現(xiàn)象，檢測上容易造成誤判、漏判，而在口岸日常檢測時經(jīng)常遇到樣品中線蟲很少，幼蟲常見，沒有成蟲或缺乏雌蟲等現(xiàn)象，如果采用形態(tài)學(xué)判斷，難以滿足快速、準(zhǔn)確、靈敏鑒定的工作需要。

近年來，利用TaqMan探針進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中添加了1條TaqMan探針。探針的5′端含有報告熒光基團，3′端含有熒光的淬滅基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，進(jìn)行PCR擴增時，TaqDNA聚合酶的5′－3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，發(fā)出熒光信號，從而使熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步［13］。目前，實時熒光PCR技術(shù)已廣泛用于病毒檢測［14－15］、細(xì)菌檢測［16］、植原體檢測［17］、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測［18］、線蟲檢測［19－20］等諸多領(lǐng)域。為此，本研究開展了木質(zhì)包裝中松材線蟲的TaqMan探針實時熒光PCR檢測技術(shù)的研究，以期獲得一種更加準(zhǔn)確、靈敏、快捷的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 線蟲樣品來源

本研究共收集不同來源的4種松材線蟲、3種擬松材線蟲、2種松材線蟲組其他線蟲，以及其他3種傘滑刃屬線蟲（見表1），除M型松材線蟲外，其他所有線蟲為進(jìn)境木質(zhì)包裝中截獲的群體。部分線蟲在長滿灰葡萄孢（Botritis cinera）菌絲PDA平板上培養(yǎng)，用改良的線蟲分離器進(jìn)行分離。

表1 線蟲來源

1.1.2 分子生物學(xué)試劑

GoTaq Flexi DNA Polymerase、MgCl2購自Promega公 司；TaKaRaTaqDNA Polymerase、dNTPs購于大連寶生物公司；引物和探針由大連寶生物公司合成。

1.2 主要儀器

ABIPRISM 7000擴增儀（ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

1.3.1.1 大量線蟲樣品DNA的提取

參考Iwahori H 等 的 方 法［21］，但 略 有 改 動。1.5mL離心管中盛有200μL含線蟲的懸浮液，再加入200μL溶解緩沖液（200mmol／L NaCl；200mmol／L Tris-HCl，pH8.0；100mmol／L EDTA，pH8.0；2%SDS；2%β－巰基乙醇）、2μL蛋白酶 K（20mg／mL），混勻。混合液65℃溫浴30min，溫浴過程中偶爾搖晃。加等體積Tris飽和酚（400μL），劇烈振蕩15s，13 000r／min離心10min，取上清。加400μL酚：氯仿：異戊醇（體積比25∶24∶1），劇烈振蕩15s，13 000r／min離心10min，取上清。加400μL氯仿：異戊醇（體積比24∶1），劇烈振蕩15s，13 000r／min離心10min，取上清。在DNA溶液中加入1／10體積的3mol／L乙酸鈉（pH4.6）和2倍體積的99.5%（－20℃）乙醇，并于－80℃下放置20min。13 000r／min離心10min，棄上清。DNA 沉 淀 用－20℃70%乙醇清洗，10 000r／min離心5min，棄上清；重復(fù)清洗1次。沉淀干燥后，用50μL左右的雙蒸水溶解。

1.3.1.2 單條或少量線蟲樣品DNA的提取

參考Zheng等的方法［11］，但有改良。將1、2、3、4條或5條線蟲分別放入加有10μL雙蒸水的研磨管中，－20℃下凍成冰塊。將凍好的研磨管取出，用研磨小杵研磨冰塊，至冰塊化開，并繼續(xù)來回研磨10次左右。用吸頭吸取研磨小杵上粘有的小水滴，放入研磨管中。向研磨管中加入8μL線蟲裂解液（125mmol／L KCl，25mmol／L Tris-Cl，pH8.3，3.75mmol／L MgCl2，2.5mmol／L DTT，1.125%Tween 20）、1μL蛋白酶 K（20mg／mL），混勻?；旌弦?5℃溫浴60min，溫浴過程中偶爾搖晃。95℃溫浴10min。13 000r／min離心1min，吸取上清液用于實時熒光PCR擴增。

1.3.2 核糖體ITS區(qū)的PCR擴增

利用傘滑刃線蟲屬通用引物，以大量線蟲樣品提取的DNA為模板，進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，即在25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2＋Plus），1μL 引物 F［22］（10μmol／L）（5′-CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3′），1μL引物R［22］（10μmol／L）（5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′），2μL dNTP （2.5mmol／L），0.2μL TaKaRaTaqDNA Polymerase（5U／μL），2μL DNA（10～100ng／μL），雙蒸水補至25μL。反應(yīng)程序為：94℃4min；然后94℃30s，54℃1min，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 實時熒光PCR檢測

以表1中大量線蟲樣品提取的DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，即在50μL反應(yīng)體系中加入10μL 5×PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2＋free），2μL引物 Pf［23］（10μmol／L）（5′-GAT GAT GCG ATT GGT GAC T-3′），2μL引物Pr［23］（10μmol／L）（5′-AAC GAC GCG AAT CGA ACC-3′），1μL 探 針Probe［23］（10 μmol／L）（5′-FAM-CGG TTG CCG CGC ATG ATG G-TAMRA-3′），4μL dNTP（2.5 mmol／L），6μL MgCl2（25mmol／L），0.4μL Go-Taq Flexi DNA polymerase（5U／μL），4μL DNA（10～100ng／μL），雙蒸水補至50μL。反應(yīng)程序為：95℃10min；然后95℃15s，60℃45s，共40個循環(huán)。

1.3.4 實時熒光PCR檢測少量及單條松材線蟲

分別以少量、單條BXmg1線蟲提取的DNA為模板，按照1.3.3進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核糖體ITS區(qū)的PCR擴增結(jié)果

12個不同種群的傘滑刃屬線蟲樣品提取的DNA均能夠得到有效的擴增，而空白對照（水）未出現(xiàn)特異性擴增，結(jié)果見圖1。

2.2 實時熒光PCR檢測結(jié)果

以4個不同批次的松材線蟲提取的DNA為模板，通過實時熒光PCR檢測，可觀察到明顯的熒光強度變化，而其他傘滑刃屬線蟲和空白對照（水）的熒光強度沒有變化，結(jié)果見圖2。

2.3 實時熒光PCR檢測少量及單條松材線蟲結(jié)果

分別以1、2、3、4、5條及大量BXmg1線蟲提取的DNA為模板，通過實時熒光PCR檢測，可觀察到明顯的熒光強度變化，而空白對照（水）的熒光強度沒有變化，結(jié)果見圖3。

圖2 實時熒光PCR擴增（ΔRn熒光信號的增加值）

圖3 少量線蟲DNA的實時熒光PCR擴增（△Rn熒光信號的增加值）

分別以單條（雄蟲、雌蟲或幼蟲）、大量BXmg1線蟲提取的DNA為模板，通過實時熒光PCR檢測，可觀察到明顯的熒光強度變化，而空白對照（水）的熒光強度沒有變化，結(jié)果見圖4。

圖4 單條線蟲DNA的實時熒光PCR擴增（ΔRn熒光信號的增加值）

3 討論

迄今為止，國內(nèi)外檢測松材線蟲的方法有形態(tài)學(xué)鑒定［24－25］、ELISA 技術(shù)、免疫印跡方法［26－27］、免疫磁性捕獲ELISA（IMS-ELISA）技術(shù)［28］、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)［29－30］、二重 PCR（Duplex PCR）技術(shù)［31］、PCR－RFLP 技 術(shù)［11，21，32］、實 時 熒 光 PCR 技術(shù)［33－35］等。形態(tài)學(xué)鑒定方法雖然簡單易行，但對線蟲不同蟲態(tài)具有一定要求，且難以將松材線蟲和同組中其他傘滑刃線蟲區(qū)分開，同時對檢測人員專業(yè)性要求高。Lawler C等曾利用抗松材線蟲的多克隆抗體檢出了歐洲赤松（Pinus sylvestrisLinn.）木材表面的微量松材線蟲蛋白質(zhì)［27］，但該方法存在操作時間較長，非特異性較明顯等缺點。曹宇等建立的免疫磁性捕獲ELISA技術(shù)雖然操作簡單，但由于沒有得到能夠區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲的特異性抗體，該方法對兩種線蟲存在一定的交叉反應(yīng)［28］。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、二重PCR（Duplex PCR）技術(shù)及PCR-RFLP技術(shù)與以往方法比較雖有很大進(jìn)步，但需進(jìn)行PCR后處理，易發(fā)生交叉污染，且對于單條線蟲無法準(zhǔn)確檢測出來。近年來的文獻(xiàn)報道，實時熒光PCR技術(shù)是目前最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好和國際公認(rèn)的核酸檢測方法，已用于諸多領(lǐng)域。近期也有學(xué)者報道利用TaqMan探針進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)檢測松材線蟲，但他們研究中用到的樣品大多采自國內(nèi)松樹上，樣品種類較少，且設(shè)計的引物和探針主要用于區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲［33－35］，至于松材線蟲組中其他線蟲很少進(jìn)行研究，而口岸進(jìn)境木質(zhì)包裝中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)松材線蟲組中的其他傘滑刃屬線蟲［36－38］。本研究中引物和探針除了能區(qū)分松材線蟲和其他傘滑刃屬線蟲，還能區(qū)分開松材線蟲組中其他線蟲，如：豆傘滑刃線蟲、大尖尾傘滑刃線蟲等。試驗中用到的M型松材線蟲是美國冷杉上發(fā)現(xiàn)的一種松材線蟲，與松樹上發(fā)現(xiàn)的松材線蟲具有一定形態(tài)差異。目前國內(nèi)外尚未見檢測M型松材線蟲的報道，本研究尚屬首次。

在提取單條及少量松材線蟲時，一些研究者用解剖刀將線蟲切斷釋放其內(nèi)容物［11，23］，筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)該方法耗工費時，操作難度大，水滴極易附著于刀片上，對試驗人員專業(yè)技術(shù)要求高，不便于普及推廣。本研究通過研磨可達(dá)到釋放線蟲內(nèi)容物的目的，操作簡單，可靠性強，尤其對單條線蟲非常適用。在研究中采用14條線蟲，分別提取單條樣品的DNA，檢測成功率為100%，且不論是雄蟲、雌蟲或幼蟲均能檢測出來。因此該研究對于我國口岸進(jìn)境木質(zhì)包裝中松材線蟲的檢測具有一定的實際意義。

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Detection ofBursaphelenchus xylophilusfrom woods packaging using real-time PCR

Guo Lixin1， Duan Weijun2， Gu Jianfeng2， Wen Weigang2， Huang Haiquan1
（1.Beilun Bureau of Entry-Exit Inspection and Quarantine，Ningbo315800，China；2.Ningbo Bureau of Entry-Exit Inspection and Quarantine，Ningbo315012，China）

Pine wood nematode is one of the major quarantine pests from imported woods packaging.In this study，twelveBursaphelenchusspecies，including four isolates ofB.xylophilusintercepted from woods packaging imported，three isolates ofB.mucronatus，one isolate ofB.doui，one isolate ofB.macromucronatus，one isolate ofB.arthuri，one isolate ofB.burgermeisteri，and one isolate ofB.paraparvispicularis，were detected using a real-time polymerase chain reaction assay.These results showed that fluorescent signal was detected only inB.xylophilusand no signals for other samples.When DNA was extracted from one nematode by grinding method，the success rate of detection was 100%，and all species of nematodes，including male，female or larva，were detected successfully.The study was helpful for detection of the pine wood nematode in imported woods packaging.

woods packaging； pine wood nematode； real-time PCR； detection

S 41－30

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.024

2010-09-17

2010-12-01

出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂計劃項目（No.2009B421x）

＊ 通信作者 E-mail：weijunduan＠yahoo.com.cn