廖富榮， 郭木金， 林石明， 陳紅運(yùn)，陳 青， 黃蓬英， 吳 媛， 謝惠明

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廈門 361026；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002）

進(jìn)境番茄種子中番茄花葉病毒的檢測與鑒定

廖富榮1， 郭木金2， 林石明1， 陳紅運(yùn)1，陳 青1， 黃蓬英1， 吳 媛1， 謝惠明1

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廈門 361026；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002）

利用雙抗夾心－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DAS-ELISA）和反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法對來自韓國的番茄種子進(jìn)行種傳病毒檢測。結(jié)果表明，在該批番茄種子中檢測到番茄花葉病毒（ToMV）和煙草花葉病毒（TMV）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，ToMV特異引物（ToA／ToB）與TMV特異引物（TA／TB）擴(kuò)增的片段均為ToMV的外殼蛋白（CP）基因及3′非編碼區(qū)（3′-UTR），該片段與其他ToMV分離物的核苷酸序列相似性為98.2%～99.9%。本研究利用重新設(shè)計(jì)合成TMV和ToMV特異引物對該批種子進(jìn)行RT-PCR檢測，僅ToMV特異性引物（ToMf1／ToMr1）擴(kuò)增到670bp的預(yù)期片段，TMV特異引物（TMf1／TMr1）則未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表明重新設(shè)計(jì)的引物可準(zhǔn)確區(qū)分ToMV和TMV。以上結(jié)果證實(shí)該批番茄種子僅攜帶ToMV。

番茄種子； 雙抗夾心－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 番茄花葉病毒； 煙草花葉病毒； 種子傳播

番茄（Lycopersicon esculentum）是全世界栽培最為普遍的果菜之一，近年來全世界番茄的消費(fèi)量以每年平均3%的速度增長。我國是世界重要的番茄生產(chǎn)國，其中加工番茄年產(chǎn)量占世界加工番茄總產(chǎn)量近20%。番茄病毒病在世界各國番茄種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重威脅番茄的安全生產(chǎn)。目前，全世界危害番茄的病毒種類有40余種［1］，并且不斷有新的病毒種類被發(fā)現(xiàn)［2－3］。近年來，危害我國番茄的病毒主要有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）［4－5］、番 茄 花 葉 病 毒 （Tomato mosaic virus，ToMV）［6］、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）［7－8］、臺 灣 番 茄 曲 葉 病 毒 （Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV）［9－10］、中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）［11］等。

在危害番茄的這些病毒中，目前已發(fā)現(xiàn)多種病毒可通過番茄種子傳播，如南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）、黃瓜花葉病毒 （Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、番茄黑環(huán)病毒（Tomato black ring virus，TBRV）、番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等［12］，以及新近發(fā)現(xiàn)的鳳果花葉病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）［13］、天竺葵環(huán)紋斑病毒 （Pelargonium zonate spot virus，PZSV）［14］。在這些種傳病毒中，ArMV、TSWV、ToRSV、TBRV等病毒是我國禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物，而PepMV、PZSV等則是我國尚未發(fā)生的病毒種類，均具有非常重要的檢疫重要性。

近20年來，基于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)方法和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的分子生物學(xué)方法發(fā)展非常迅速，已被廣泛應(yīng)用于植物病原菌的檢測鑒定中，其中雙抗夾心酶聯(lián)免疫 吸 附 法 （double antibody sandwich enzymelinked immunosorbent assay，DAS-ELISA）和反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）PCR因具有高度的專一性和靈敏度，又可在短時(shí)間內(nèi)得到結(jié)果，已成為檢測鑒定植物病毒的重要方法［15］。目前，國內(nèi)外對番茄病毒的檢測多是針對番茄病葉來進(jìn)行的［4－11，16－17］，而很少針對番茄種子攜帶的病毒進(jìn)行直接檢測鑒定。本文報(bào)道了利用DAS-ELISA方法初篩，然后用RT-PCR方法及序列測定進(jìn)行驗(yàn)證，在來自韓國的番茄種子中檢測到番茄花葉病毒（ToMV），為番茄種子攜帶的病毒檢測提供了一個(gè)更為快速、可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 番茄種子

檢測樣品為2010年4月來自韓國的一批番茄（Lycopersicon esculentum）種子，品種為‘黑妃’、‘黃妃’、‘紅妃’。

1.2 檢測試劑

用于DAS-ELISA檢測的多克隆抗體及陽性對照樣品購自美國Agdia公司，檢測的病毒種類包括南芥菜花葉病毒（ArMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、番茄花葉病毒（ToMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）、番茄環(huán)斑病毒（ToRSV）、鳳果花葉病毒（PepMV）、番茄黑環(huán)病毒（TBRV）。

TRIzol Reagent購自Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司，RNasin、TaqDNA聚合酶、dNTPs購自TaKaRa公司，其他試劑為國產(chǎn)的分析純。

1.3 樣品的制備

稱取0.6g番茄種子至研磨罐（30mL）中，在MM400研磨儀（Retsch）上以28次／s頻率研磨3min，把粉末轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入3mL的樣品提取緩沖液并混合均勻，然后8 000r／min離心5min，上清液用于DAS-ELISA檢測。

另外，取100μL的上述樣品提取液，用TRIzol Reagent方法，根據(jù)試劑說明提取總RNA，用于RTPCR檢測。

1.4 DAS-ELISA檢測

根據(jù)試劑說明書（Agdia），進(jìn)行 DAS-ELISA檢測。其中，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，每孔加入檢測樣品提取液100μL，并設(shè)置陽性和陰性對照。在陽性對照明顯顯色后（約20min），在酶標(biāo)儀中讀取吸光值A(chǔ)405。

1.5 RT-PCR檢測

反轉(zhuǎn)錄：在3μL的總RNA中加入1μL的3′端引物（10μmol／L），于95℃的水浴中處理7min，然后迅速冰浴5min。繼續(xù)加入5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2.5μL、dNTP混合液2μL （2.5mmol／L）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、RNasin 0.5μL、無菌去離子水3μL。然后37℃水浴處理1h，95℃水浴10min，冷卻后，作為PCR擴(kuò)增的DNA模板。

在25μL的反應(yīng)體系中：10×PCR buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP混合液2μL（每種各2.5mmol／L），Taq聚合酶0.3μL（5U／μL），上游引物1.5μL（10μmol／L），下游引物1.5μL（10μmol／L），DNA模板3μL，無菌去離子水14.2μL。

ToMV特異性引物及其序列見表1，其中引物對 ToA／ToB根據(jù)文獻(xiàn)合成［18］，ToMf1／ToMr1為重新設(shè)計(jì)合成的引物，擴(kuò)增區(qū)域均為ToMV的CP基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

表1 用于RT-PCR擴(kuò)增的ToMV特異性引物及其序列1）

TMV特異性引物及其序列見表2，其中引物對TA／TB根據(jù)文獻(xiàn)合成［18］，TMf1／TMr1為重新設(shè)計(jì)的特異性引物，擴(kuò)增區(qū)域均為TMV的CP基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

表2 用于RT-PCR擴(kuò)增的TMV特異性引物及其序列1）

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察、拍照。

1.6 序列測定與分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，進(jìn)行克隆測序（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成）。用軟件DNAMAN Version 6.0（Lynnon BioSoft）及BLAST（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進(jìn)行序列分析。用于比較的番茄花葉病毒序列登錄號：X02144、NC＿002692、AJ132845、AJ243571、AJ417701、Z92909、FN-985165、AF332868、AB083196、AF155507、GQ280794、AJ132845、AJ011934、Z98201、AB355139、DQ873692；煙草花葉病毒序列登錄號：NC＿001367、AF395127、AF165190、AJ011933、X68110、D63809。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測

根據(jù)試劑說明，利用DAS-ELISA對番茄種子的提取液進(jìn)行檢測，每個(gè)檢測樣品重復(fù)1次，取平均值。DAS-ELISA檢測結(jié)果表明，在8個(gè)檢測樣品中，TMV和ToMV兩個(gè)檢測項(xiàng)目的A405值分別在1.795～2.367和1.975～2.018之間，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2倍的陰性對照A405值，TMV和ToMV血清學(xué)檢測結(jié)果呈陽性（表3）；其余檢測項(xiàng)目中的檢測樣品A405值均小于2倍的陰性對照A405值，檢測結(jié)果呈陰性。根據(jù)DAS-ELISA檢測結(jié)果，初步判斷該批番茄種子中攜帶有煙草花葉病毒（TMV）和番茄花葉病毒（ToMV）。

表3 番茄種子中ToMV及TMV的DAS-ELISA檢測結(jié)果（A405值）

2.2 ToMV的RT-PCR檢測與序列測定

2.2.1 RT-PCR檢測

取100μL的檢測樣品提取液，用TRIzol Reagent提取總RNA，然后用ToMV特異引物ToA／ToB進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在檢測樣品中均產(chǎn)生了一條與ToMV陽性對照樣品大小一致的條帶（大小均約為700bp），而陰性對照及空白對照沒有擴(kuò)增到該目的條帶（圖1）。因此，該檢測樣品ToMV的RT-PCR特異性檢測結(jié)果呈陽性。

圖1 番茄種子中ToMV特異引物ToA／ToB的RT-PCR檢測結(jié)果

2.2.2 序列測定與分析

PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行克隆測序。測序結(jié)果表明，ToA／ToB引物的擴(kuò)增片段為703bp，含有上下游引物的相應(yīng)序列，與預(yù)期大小一致。序列分析表明，該片段為ToMV的3′末端序列，包括480nts的外殼蛋白（CP）基因和201nts的3′端非編碼區(qū)（3′-UTR），該序列的GenBank登錄號為HM623426（命名為ToMV-Kr）。

序列比較結(jié)果（表4）顯示，ToMV-Kr與其他ToMV的CP基因及3′-UTR序列的相似性為98.2%～99.9%，與 TMV相應(yīng)序列的相似性為76.3%～76.9%。其中，與新疆加工番茄上的XJT－1（FN985165）分離物相似性最高，達(dá)99.9%。

表4 引物ToA／ToB和TA／TB擴(kuò)增的序列與已知ToMV和TMV分離物的序列相似性

2.3 TMV的RT-PCR檢測與序列測定

2.3.1 RT-PCR檢測

番茄種子的各檢測樣品血清學(xué)檢測結(jié)果不僅顯示ToMV陽性，而且TMV血清學(xué)檢測也呈現(xiàn)陽性結(jié)果，因而很可能也有TMV存在。用TMV的特異性引物TA／TB對番茄種子樣品進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，各檢測樣品中均產(chǎn)生一條與TMV陽性對照大小一致的條帶，大小約為700bp，而陰性對照和空白對照均沒有產(chǎn)生預(yù)期大小的條帶（圖2）。因此，該檢測樣品TMV的RTPCR特異性檢測結(jié)果呈陽性。

圖2 番茄種子中TMV特異引物TA／TB的RT-PCR檢測結(jié)果

2.3.2 序列測定與分析

對TA／TB引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，結(jié)果表明獲得了一條698nts的條帶，包含有上下游引物相對應(yīng)的序列。去除上下游引物5′端中額外引入的酶切位點(diǎn)序列，序列長度為681nts。序列分析表明，不包括引物序列位置，該序列與ToA／ToB引物擴(kuò)增的序列長度也完全相同，且只存在3個(gè)堿基的差異。序列分析顯示，該序列與GenBank上煙草花葉病毒相應(yīng)外殼蛋白（CP）基因及3′－端非 編 碼 區(qū) （3′-UTR）序 列 的 相 似 性 在 75.5% ～76.3%之間，但與已知的番茄花葉病毒相應(yīng)外殼蛋白（CP）基因及3′-端非編碼區(qū)（3′-UTR）序列具有更高的相似性，核苷酸序列相似性在98.4%～99.4%之間（表4）。從序列相似性分析結(jié)果來看，TMV特異引物TA／TB擴(kuò)增到的片段并不是TMV病毒的基因組序列，而是ToMV病毒的基因組序列。因而，TMV的特異性RT-PCR檢測結(jié)果產(chǎn)生了假陽性。

2.4 特異性引物的重新設(shè)計(jì)與應(yīng)用

由于TA／TB引物在檢測TMV時(shí)出現(xiàn)了假陽性結(jié)果，本研究比較分析TMV和ToMV的基因組序列，在差異較大的區(qū)域重新設(shè)計(jì)了TMV特異引物TMf1／TMr1（表2）和 ToMV特異引物 ToMf1／ToMr1（表1），并利用這兩對特異性引物重新對番茄種子樣品進(jìn)行 RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，僅ToMf1／ToMr1在番茄種子樣品中擴(kuò)增到與陽性對照一致的條帶（圖3），TMf1／TMr1則未擴(kuò)增到預(yù)期條帶（圖4），表明重新設(shè)計(jì)的引物可用于TMV和ToMV的特異性檢測。

3 討論

ToMV和TMV是常見的番茄種傳病毒，均為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員，其中ToMV的種傳率可達(dá)24%［19］。本研究采用 DAS-ELISA方法從來自韓國的一批番茄種子中檢測到ToMV和TMV。利用已報(bào)道的TMV特異性引物TA／TB和ToMV特異性引物ToA／ToB［18］對血清學(xué)陽性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，兩種病毒的RT-PCR結(jié)果均呈陽性。通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序發(fā)現(xiàn)，兩對引物TA／TB和ToA／ToB擴(kuò)增的片段均為ToMV基因組序列，即引物TA／TB無法用于TMV的特異性檢測。進(jìn)一步的序列比對表明，引物TA／TB和引物ToA／ToB擴(kuò)增的區(qū)域均為CP基因和3′-UTR，在此區(qū)域ToMV和TMV差異較小，這可能是造成非特異性擴(kuò)增的重要原因。本研究選擇ToMV和TMV基因組差異性較大的區(qū)域重新設(shè)計(jì)了兩種病毒的特異性引物，對血清學(xué)陽性樣品進(jìn)行RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)僅ToMV出現(xiàn)目標(biāo)條帶。因此，在兩種病毒差異性比較大的區(qū)域設(shè)計(jì)合成特異引物，是PCR檢測中產(chǎn)生特異性擴(kuò)增的重要保證。

本研究從用于血清學(xué)檢測的樣品提取液中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，不僅減少了重新研磨種子的步驟，而且真正實(shí)現(xiàn)了對血清學(xué)檢測陽性樣品的直接驗(yàn)證。在病毒的日常血清學(xué)檢測中，由于抗體的特異性等原因，有可能會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因此，使用PCR等分子檢測技術(shù)可有效避免單一方法產(chǎn)生的假陽性問題。

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Detection and identification of theTomato mosaic virusin imported tomato seeds

Liao Furong1， Guo Mujin2， Lin Shiming1， Chen Hongyun1，Chen Qing1， Huang Pengying1， Wu Yuan1， Xie Huiming1
（1.Center of Inspection ＆Quarantine Technology，Xiamen Bureau of Entry-Exit Inspection and Quarantine，Xiamen361026，China； 2.Fujian Agricultural and Forestry University，F(xiàn)uzhou350002，China）

The tomatoLycopersicon esculentumseeds imported from South Korea were detected with DAS-ELISA and RT-PCR methods.The results showed that both theTobacco mosaic virus（TMV）and theTomato mosaic virus（ToMV）were found in the seed lots.Sequence determination proved that the fragment（703 bp）with ToMV-specific primers（ToA／ToB）and the fragment（698 bp）with TMV-specific primers（TA／TB）were composed of coat protein gene and 3′-UTR of ToMV，sharing identities of 98.2%－99.9%with other ToMV isolates at nucleotide sequence level，which indicated that the previously published primer pair TA／TB was not suitable for diagnosis of TMV.In this study，the primers ToMf1／ToMr1 and TMf1／TMr1 were designed for discriminating between ToMV and TMV and validated on the ELISA positive samples.The expected RT-PCR products（670 bp）of ToMf1／ToMr1 specific to ToMV were readily visible in the ELISA positive samples，while no target fragment（677 bp）of TMf1／TMr1 specific to TMV was observed.

tomato seed； DAS-ELISA； RT-PCR；Tomato mosaic virus；Tobacco mosaic virus； seed transmission

S 436.412.11

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.023

2010-09-03

2010-09-28

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201010256）；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010IK272）；廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2006XK06）

聯(lián)系方式 Tel：0592-3269916；E-mail：lfr005＠163.com