賈春生

（韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院，韶關(guān) 512005）

廣東省白背飛虱病原真菌的分離鑒定和培養(yǎng)

賈春生

（韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院，韶關(guān) 512005）

［目的］了解廣東省白背飛虱（Sogatella furcifera）的昆蟲病原真菌資源及其生物學(xué)特性。［方法］對從廣東韶關(guān)市曲江區(qū)感染真菌病的白背飛虱中分離出的2種昆蟲病原真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，并測定了不同溫度（10、15、20、25、30、35℃和37℃）和光周期（L∥D＝24h∥0h和 L∥D＝0h∥24h）對2種蟲生真菌生長的影響。［結(jié)果］寄生白背飛虱的2種蟲生真菌經(jīng)鑒定為大孢巴科霉（Batkoa major）和冠耳霉（Conidiobolus coronatus），對它們的形態(tài)特征進(jìn)行了描述。生物學(xué)試驗(yàn)表明，2種真菌在15～30℃均可生長，生長速度隨著溫度升高而加快。在35℃冠耳霉生長速度開始下降，在37℃其生長速率接近于0。L∥D＝24h∥0h和L∥D＝0h∥24h2種光周期對2種真菌生長影響不顯著。［結(jié)論］寄生白背飛虱的蟲生真菌分別為大孢巴科霉和冠耳霉，其生長主要受溫度影響。

白背飛虱； 大孢巴科霉； 冠耳霉； 溫度； 光周期

白背飛虱［Sogatella furcifera（Horváth）］屬同翅目，飛虱科，成蟲和若蟲群集稻株莖基部刺吸汁液，并產(chǎn)卵于葉鞘組織中，致使植株生長受阻，甚至死苗和倒伏，導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)或失收。20世紀(jì)70年代以前白背飛虱僅在西南及閩北發(fā)生頻次高，80年代以來，由于東南亞和我國南方稻區(qū)大面積推廣種植抗褐飛虱而不抗白背飛虱的IR系列和雜交稻品種，該蟲在我國各稻區(qū)的發(fā)生面積和大發(fā)生頻率明顯增加，對水稻危害日趨嚴(yán)重。90年代其發(fā)生面積和危害損失已超過褐飛虱，成為對水稻生產(chǎn)威脅最大的飛虱類害蟲［1］。但長期以來，白背飛虱在我國屬于次要害蟲，因此研究基礎(chǔ)比較薄弱，其防治技術(shù)相對滯后，基本以化學(xué)防治為主。國外很早就非常重視白背飛虱病原真菌研究［2－4］，目前我國對褐飛虱的病原真菌報(bào)道較多，而對于白背飛虱的病原真菌僅發(fā)現(xiàn)有飛虱蟲癘霉（Pandora delphacis）以及球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和枝孢霉（Cladosporiumspp.），未見其他昆蟲病原真菌的報(bào)道［5－9］。近年，筆者在進(jìn)行廣東省昆蟲病原真菌資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，除飛虱蟲癘霉外，還有2種蟲霉目昆蟲病原真菌經(jīng)常在白背飛虱種群中引發(fā)流行病，經(jīng)鑒定這2種真菌為大孢巴科霉（Batkoa major）和冠耳霉（Conidiobolus coronatus），現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下，以便為白背飛虱的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白背飛虱病原真菌的分離鑒定

1.1.1 標(biāo)本采集與觀察

2008年7月7日，在廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)大塘鎮(zhèn)晚稻田（水稻品種為‘豐優(yōu)236’）采集感染病原真菌的白背飛虱成蟲和若蟲，帶回室內(nèi)觀察和鑒定。采用Keller的方法［10］制片，醋酸地衣紅或乳酚棉藍(lán)染色后進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察。用顯微鏡測微尺測量初生分生孢子、次生分生孢子、分生孢子梗、假囊狀體、假根和菌絲段的大小，分生孢子大小以長徑×短徑表示，分生孢子的長短徑比，以L／D表示。每個測量項(xiàng)目的數(shù)值以平均值±SD表示，每個項(xiàng)目的測量樣本數(shù)均為50。顯微圖片采用萊卡（LeicaDM5000A）光學(xué)顯微鏡拍攝。

1.1.2 分離與鑒定

選取新鮮感染白背飛虱蟲尸用雙面膠帶將其背部朝下粘貼到SDAY平板培養(yǎng)基皿蓋內(nèi)壁，置20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，更換新的培養(yǎng)皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)，待觀察到有蟲霉目真菌生長后立即轉(zhuǎn)接至新的SDAY培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

按 Humber［11］的蟲霉目分類系統(tǒng)，結(jié)合 Keller［12－13］和李增智［8］等文獻(xiàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2 溫度對大孢巴科霉和冠耳霉菌落生長的影響

將大孢巴科霉和冠耳霉孢子懸浮液分別均勻涂布到SDAY平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3d后，用直徑為5mm打孔器在菌落邊緣打取菌片，接種到SDAY平板培養(yǎng)基中央（培養(yǎng)皿直徑9cm），然后分別放入15、20、25、30、35℃和37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個溫度設(shè)3次重復(fù)，連續(xù)觀察5d（因冠耳霉生長3d菌落直徑即接近培養(yǎng)皿的直徑9cm，所以只觀察3d）。每天用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑，每個菌落分取3個方向測量，取其平均值。

1.3 光周期對大孢巴科霉和冠耳霉菌落生長的影響

接種方法同1.2，培養(yǎng)溫度為20℃，設(shè)置L∥D＝24h∥0h和L∥D＝0h∥24h2種光周期，連續(xù)觀察7d。每天用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑，每個菌落分取3個方向測量，取其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS17.0對從1.2和1.3所獲取的菌落生長試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 白背飛虱昆蟲病原真菌的鑒定

從感病的白背飛虱中分離到2種蟲霉目昆蟲病原真菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)性狀，將它們鑒定為以下2個種。

2.1.1 大孢巴科霉［Batkoa major（Thaxter）Humber］

大孢巴科霉可以感染長翅型和短翅型的白背飛虱，尸體頭部朝上以假根附著于水稻植株上部葉片的中上部，雙翅常向兩側(cè)張開。病原真菌子實(shí)層白色，多從腹部節(jié)間膜長出，形成明顯的白環(huán)，側(cè)板處子實(shí)層尤為濃密，有時在尸體周圍可見彈射出的白色孢子堆（圖1a，b）。

初生分生孢子無色，透明；含多個細(xì)胞核，直徑（2.5±0.3）μm；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物細(xì)粒狀；單囊壁；球形或近球形，（40.6±2.4）μm×（34.0±1.7）μm，L／D為1.2±0.1，基部乳突明顯，（11.4±1.0）μm×（6.5±2.0）μm（圖1c）。次生分生孢子與初生分生孢子 同 形，略 小，（35.5±2.3）μm× （29.6±4.8）μm，L／D為1.2±0.1（圖1d）。菌絲段菌絲狀，直徑（11.7±3.2）μm（圖1e）。分生孢子梗不分支，近孢子處呈明顯的頸狀縊縮，直徑（17.6±3.3）μm（圖1f，g）。假囊狀體未見。假根單菌絲狀，末端具圓盤狀的固著器。在SDAY培養(yǎng)基形成的休眠孢子球形，直徑（20.6±1.7）μm，外壁光滑，壁厚（1.3±0.2）μm（圖1h）。

在SDAY培養(yǎng)基上生長速度快，菌落表面灰白色，20℃培養(yǎng)5d菌落直徑（5.53±0.41）cm，菌落表面具較深的放射狀皺褶（圖1i）。

圖1 大孢巴科霉感染白背飛虱的癥狀及其形態(tài)特征

2.1.2 冠耳霉［Conidiobolus coronatus（Cost.）Batko］

冠耳霉感染長翅型白背飛虱，感染死亡的尸體頭部朝上附著于水稻植株上部葉片，雙翅有時向兩側(cè)張開。病原真菌子實(shí)層灰白色，多從腹部節(jié)間膜長出，形成較明顯的白環(huán)。

初生分生孢子無色，含多個細(xì)胞核；單囊壁；球形或近球形，（50.6±5.7）μm×（47.4±3.7）μm，L／D為1.1±0.1，基部乳突粗鈍或較尖銳（圖2a）。次生分生孢子與初生分生孢子同形，略小。微小孢子球形，（24.7±4.6）μm×（22.1±3.4）μm，L／D 為1.1±0.1（圖2b）。柔毛孢子球形，直徑（50.4±4.8）μm（圖2c）。菌絲段不規(guī)則。分生孢子梗不分支。假囊狀體和假根未見。

在SDAY培養(yǎng)基上生長速度非?？欤浔砻婊野咨?，粉狀，表面具放射狀皺褶，20℃培養(yǎng)3d菌落直徑（5.02±0.41）cm。分生孢子強(qiáng)力彈射，常在菌落邊緣附近形成許多小菌落，培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)布滿濃密的灰白色分生孢子層（圖2d）。

2.2 溫度對大孢巴科霉和冠耳霉菌落生長的影響

2.2.1 溫度對大孢巴科霉菌落生長的影響

從表1可以看出，大孢巴科霉在10～30℃均能生長，生長速度隨著溫度升高而加快，尤以25～30℃增加最快，30℃5d菌落直徑可達(dá)（8.50±0.00）cm。除10℃外，在其他各溫度下，1～5d菌落生長速度均逐日顯著增加。

2.2.2 溫度對冠耳霉菌落生長的影響

從表2可以看出，冠耳霉在15～35℃均能生長，在15～30℃生長速度隨著溫度升高而加快，尤以25～30℃增加最快，30℃3d菌落直徑即可達(dá)（8.50±0.00）cm。但從35℃以后，生長速度明顯下降，到37℃生長幾乎停止。因此該菌最適溫度為30℃。除10℃外，在其他各溫度下，1～5d菌落生 長速度均逐日顯著增加。

表1 溫度對大孢巴科霉菌落生長的影響1）

圖2 感染白背飛虱的冠耳霉形態(tài)特征

表2 溫度對冠耳霉菌落生長的影響1）

2.3 光周期對大孢巴科霉和冠耳霉菌落生長的影響

從表3可以看出，在20℃1～7d內(nèi)，L∥D＝24h∥0h和L∥D＝0h∥24h2種光周期對大孢巴科霉和冠耳霉的菌落生長均無顯著影響。

3 討論

1988年，鄭本暖等在國內(nèi)首次從擬褐飛虱（Nilaparvata bakeri）中發(fā)現(xiàn)了大孢巴科霉（當(dāng)時稱為大孢耳霉），隨后又相繼從桃蚜和毛蠓發(fā)現(xiàn)了該菌［8，13］。國內(nèi)未見該菌感染白背飛虱的報(bào)道。Holdom等在印度尼西亞進(jìn)行稻飛虱天敵調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)了一種感染白背飛虱的病原真菌（Entomophagasp.）［3］，根據(jù)其對白背飛虱感染癥狀（尸體以假根固著于植株上，子實(shí)層在腹部節(jié)間膜形成白環(huán)）的描述以及感染死亡尸體分布于水稻植株上部葉片判斷，該菌可能就是大孢巴科霉。目前只有冠耳霉感染褐飛虱的報(bào)道，未見感染白背飛虱的 報(bào) 道［4，14-15］。

表3 20℃時光周期對大孢巴科霉和冠耳霉菌落生長的影響1）

大孢巴科霉和冠耳霉感染白背飛虱的癥狀極為相似，主要區(qū)別在于前者形成假根，后者不形成。在顯微鏡下，根據(jù)是否存在小孢子和柔毛孢子極易區(qū)分這兩種真菌。大孢巴科霉和冠耳霉都易于在SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而且生長速度快，后者尤為突出。顯示出它們可能對白背飛虱具有很快的致死速度。在鏡檢大孢巴科霉感染的白背飛虱標(biāo)本時，常見其雌蟲體內(nèi)仍懷有卵，這也表明該菌的確對白背飛虱致死速度很快，可以在雌蟲尚未產(chǎn)卵前將其致死。因此，該菌對白背飛虱具有較強(qiáng)的控制能力。冠耳霉是一種分布廣泛的昆蟲病原真菌，可感染多種昆蟲，也可腐生于土壤和植物組織中［8］。該菌是引起人耳霉病的2種病原真菌之一，目前國內(nèi)有1例其引起的耳霉病報(bào)道［16］。但從本文對冠耳霉的培養(yǎng)來看，當(dāng)溫度達(dá)到35℃以后，它的生長速度明顯下降，到37℃生長幾乎停止，因此，本文中分離到的菌株對人體應(yīng)該是比較安全的。但是，由于冠耳霉不同菌株可能具有不同生物學(xué)特性，對該菌的研究應(yīng)該慎重。另外，在進(jìn)行稻飛虱田間調(diào)查時也要注意人身防護(hù)。

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Isolation，identification and culture of entomopathogenic fungi fromSogatella furciferain Guangdong Province

Jia Chunsheng
（Yingdong College of Bioengineering，Shaoguan University，Shaoguan512005，China）

［Objective］To understand the resources of entomopathogenic fungi onSogatella furciferain Guangdong Province and their biological characteristics.［Method］Two species of entomopathogenic fungi，isolated from mycosed adultS.furciferain the Qujiang District of Shaoguan City，Guangdong Province，were morphologically described from their host insects and from microscopic preparations.The effects of seven different temperatures（10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃and37℃）and two different photoperiods（L∥D＝24 h∥0h and L∥D＝0h∥24 h）on radial growth of the two species of entomopathogenic fungi were studied in the laboratory.［Result］The two fungi species isolated fromS.furciferawere identified asBatkoa majorandConidiobolus coronatus，based on morphological method.They could grow at 15－30℃，and their growth rates were enhanced as temperature increased.At 35℃，the growth rate ofC.coronatusbegan to decrease.At 37℃，the growth rate was close to zero.Two different photoperiods insignificantly affected their radial growth.［Conclusion］The entomopathogenic fungi parasitingS.furciferawere mainlyBatkoa majorandConidiobolus coronatus，whose growth were mainly affected by temperature.

Sogatella furcifera；Batkoa major；Conidiobolus coronatus； temperature； photoperiod

S 476.12

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.016

2010-10-21

2010-12-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（39870647）

聯(lián)系方式 E-mail：chunshengjia68＠yahoo.com.cn