李瑞芳， 趙玉峰， 楊世清， 伊艷杰， 田泱源

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省科學(xué)院同位素研究所有限公司，鄭州 450052）

枯草芽胞桿菌BS501a復(fù)合誘變菌株及抗菌譜研究

李瑞芳1， 趙玉峰1， 楊世清2， 伊艷杰1， 田泱源1

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省科學(xué)院同位素研究所有限公司，鄭州 450052）

［目的］通過(guò)復(fù)合誘變進(jìn)一步提高枯草芽胞桿菌BS501a的生防效果。［方法］以BS501a為出發(fā)菌株，采用N＋離子注入和60Coγ射線(xiàn)照射進(jìn)行復(fù)合誘變。［結(jié)果］獲得了5株拮抗活性提高的突變菌株。傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)表明BSC45菌株經(jīng)5次傳代后拮抗穩(wěn)定性仍保持在88.3%。該突變株各代與稻瘟病菌對(duì)峙培養(yǎng)拮抗帶寬平均為7.5mm，比出發(fā)菌株BS501a與稻瘟病菌對(duì)峙培養(yǎng)拮抗帶寬6.05mm提高了24%。采用對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)研究BSC45抗菌譜，發(fā)現(xiàn)BSC45仍保留了廣譜拮抗活性。［結(jié)論］枯草芽胞桿菌突變株BSC45對(duì)多種真菌有抗菌作用，是一株很有潛力的生防菌株。

N＋離子注入；60Coγ射線(xiàn)輻照； 復(fù)合誘變； 拮抗活性； 抗菌譜

采用物理或化學(xué)因素進(jìn)行誘變育種是一種被普遍應(yīng)用的有效育種方法。通常情況下，復(fù)合誘變比單因素誘變效果好［1］。離子注入誘變是近年發(fā)展較快的一種輻射誘變技術(shù)。

該技術(shù)應(yīng)用于微生物育種，使生物體死亡、自由基間接損傷、染色體重復(fù)、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等，具有突變率高、突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)［2］，是一種常見(jiàn)的真核生物誘變育種技術(shù)，細(xì)菌的誘變育種僅見(jiàn)于芽胞桿菌。γ射線(xiàn)是一種波長(zhǎng)短，穿透力強(qiáng)，攜帶高能量，且能產(chǎn)生電離作用的電磁波，直接或間接地改變DNA結(jié)構(gòu)。直接效應(yīng)表現(xiàn)為使脫氧核糖的堿基發(fā)生氧化或脫氧核糖的化學(xué)鍵和糖－磷酸相連接的化學(xué)鍵斷裂，使DNA單鏈或雙鏈鍵斷裂；其間接效應(yīng)是電離輻射使水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，這些自由基與細(xì)胞中的溶質(zhì)分子起作用，發(fā)生化學(xué)變化，作用于DNA分子而引起堿基缺失和DNA損傷。此外，電離輻射還能引起染色體畸變，染色體斷裂，染色體結(jié)構(gòu)的缺失、易位和倒位等［3］。

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）在自然界廣泛存在，是具有多種有益功能的微生物。如存在于植物根際的枯草芽胞桿菌具有生防作用，存在于動(dòng)物腸道中的枯草芽胞桿菌具有水解淀粉的作用等。作者從河南省黃河邊水稻田的土壤中分離出一株拮抗譜廣、生長(zhǎng)快的枯草芽胞桿菌BS501a［4］，與多種植物病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)，拮抗帶寬能夠達(dá)到5～8mm。為進(jìn)一步提高枯草芽胞桿菌BS501a的生防效果，選育出拮抗性能更高的突變菌株，本研究采用N＋注入和60Coγ射線(xiàn)輻照，對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變處理，為將BS501a開(kāi)發(fā)為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生防菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

枯草芽胞桿菌菌株BS501a為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏［4］，黃瓜鐮刀菌（Fusariumspp.）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.ex Fr.）、玉米青枯病 菌（Fusarium graminearumSchw.）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydisShoem.）、玉米串珠鐮孢（Fusarium moniliformeSheld.）、小麥根腐病菌［Bipolaris sorokiniana（Sacc.）Shoem.］、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealisvander Hoeven）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearumSchw.）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb.）、棉花枯萎病菌［Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum（Atk.）］、禾生腐霉（Pythium graminicolaSubramanian）、番茄早疫病菌［Alternaria solani（Ellis et Martin）sorauer］由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。稻瘟病菌［Magnaporthe grisea（Hebert）Barrnov.］、辣椒枯萎病 菌 ［Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum（Atk.）］、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、蘋(píng)果輪紋病菌（Botryosphaeria berengerianaf.sp.piricolaKoganezawa et Sakuma）、蘋(píng)果腐爛病菌（Cytosporasp.）由河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

枯草芽胞桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，植物病原真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

離子注入機(jī)由鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；

60Coγ放射源由河南省科學(xué)院同位素研究所有限公司提供。

1.3 枯草芽胞桿菌BS501a誘變前培養(yǎng)

挑取新鮮培養(yǎng)的枯草芽胞桿菌單菌落，接入新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h。按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于裝有50mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)24h。此時(shí)，枯草芽胞桿菌大部分以芽胞形式存在。

1.4 離子束誘變

BS501a菌株離子束誘變按李淑榮的方法［5］進(jìn)行，并略作改動(dòng)。

1.4.1 離子注入誘變

由于芽胞的耐受性較強(qiáng)，高劑量下芽胞的存活率比較高。因此，選用芽胞為出發(fā)菌進(jìn)行誘變，可使用較高的誘變劑量，以便得到更多的正向變異株。吸取培養(yǎng)24h的菌液0.1mL，均勻涂布于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上吹干成菌膜，取鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊的平皿，進(jìn)行離子注入。靶室抽真空至10－3Pa。注入離子為N＋，能量為30keV，注入劑量為5×1014、10×1014、30×1014、50×1014、80×1014、100×1014N＋／cm2和150×1014N＋／cm2，真空度為10－3Pa。設(shè)無(wú)離子注入的真空對(duì)照。

1.4.2 菌體計(jì)數(shù)

離子注入后，將1mL無(wú)菌生理鹽水加入到培養(yǎng)皿中浸泡菌膜10min，并不斷搖晃培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)皿上的菌體充分洗脫下來(lái)。收集菌液于試管中，進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e取0.2mL涂于預(yù)先制備好的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 60Coγ射線(xiàn)誘變

將離子束二次誘變后篩選到的高活性菌株37℃振蕩培養(yǎng)24h，取100μL菌懸液涂于LB平板上，面積呈1元硬幣大小。培養(yǎng)過(guò)夜后，進(jìn)行60Coγ射線(xiàn)照射［6］，照射劑量分別設(shè)為100、200、400、800、1 500Gy和3 000Gy，每個(gè)劑量1個(gè)平板。將照射后的平板用1mL無(wú)菌水沖洗，適當(dāng)稀釋后涂LB平板，25℃培養(yǎng)48h后，挑取單菌落進(jìn)行篩選。

1.6 誘變菌株篩選

隨機(jī)挑取誘變處理后的菌株，移植到LB斜面，25℃下培養(yǎng)36h。以水稻稻瘟病菌為指示菌進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，具體方法如下：在不帶菌PDA平板上距平板中心2.5cm處呈對(duì)角線(xiàn)接測(cè)試突變菌株和對(duì)照菌株，在平板中央移入新鮮培養(yǎng)的直徑5mm稻瘟病菌菌餅，26～28℃，14h光照、10h黑暗交替培養(yǎng)72h，測(cè)量拮抗帶寬度，篩選拮抗能力提高的突變株。每個(gè)測(cè)試菌株進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.7 誘變效果的計(jì)算

1.7.1 存活率

存活率的計(jì)算采用菌落計(jì)數(shù)法，分別計(jì)算真空對(duì)照組和離子注入組的菌落總數(shù)，計(jì)算公式如下：

存活率＝（離子注入后存活細(xì)胞數(shù)／真空對(duì)照存活細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7.2 突變率的計(jì)算

將誘變后的存活菌株進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，以對(duì)照菌株的拮抗帶寬為標(biāo)準(zhǔn)，將拮抗帶寬與對(duì)照菌株不同的測(cè)試菌株稱(chēng)為突變菌株，拮抗帶寬度增加10%以上的為正突變菌株，拮抗帶寬度減少10%以上的為負(fù)突變菌株。根據(jù)拮抗帶寬度分別計(jì)算總突變率、正突變率及負(fù)突變率等。計(jì)算公式如下：

總突變率＝突變菌株總數(shù)／測(cè)試菌株總數(shù)×100%；正突變率＝（正突變菌株數(shù)／突變菌株總數(shù)）×100%；負(fù)突變率＝（負(fù)突變菌株數(shù)／突變菌株總數(shù)）×100%。

1.8 抗菌譜測(cè)定

采用對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定枯草芽胞桿菌突變株的抗菌譜。由于植物病原真菌生長(zhǎng)速度不同，為準(zhǔn)確判斷枯草桿菌突變株的拮抗活性，采用枯草芽胞桿菌突變株與植物病原真菌分期或同期培養(yǎng)的方法。對(duì)生長(zhǎng)速度較快的植物病原真菌，先在新鮮PDA平板上呈對(duì)角線(xiàn)接種枯草桿菌突變株，26℃培養(yǎng)24h后，在平板中央移入受試真菌菌餅，而后繼續(xù)培養(yǎng)48h，測(cè)量拮抗帶寬度。對(duì)生長(zhǎng)速度中等的植物病原真菌，采用在新鮮PDA平板中央接種受試真菌菌餅，同時(shí)圍繞菌餅呈對(duì)角線(xiàn)接種枯草桿菌突變株，26℃培養(yǎng)72h，測(cè)量拮抗帶寬度。對(duì)生長(zhǎng)速度較慢的植物病原真菌，采用在新鮮PDA平板中央接種受試真菌菌餅，26℃培養(yǎng)24h后，在平板上呈對(duì)角線(xiàn)接種枯草桿菌突變株，繼續(xù)培養(yǎng)72h，測(cè)量拮抗帶寬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 N＋離子注入誘變效應(yīng)

2.1.1 N＋離子注入BS501a存活曲線(xiàn)

采用N＋為離子注入源，不同注入劑量處理的菌體存活率見(jiàn)圖1。

從圖1可知，菌株存活率曲線(xiàn)呈現(xiàn)較明顯的先降后升再降的“馬鞍形”變化，即小劑量注入時(shí)存活率較高，隨劑量增加存活率下降，當(dāng)注入劑量增至30×1014ions／cm2時(shí)，存活率降為20%，但劑量繼續(xù)增加至100×1014ions／cm2時(shí)，存活率回升到31%，然后又逐漸下降，注入劑量為150×1014ions／cm2時(shí)的存活率為26%。

圖1 N＋離子注入BS501a的存活曲線(xiàn)

2.1.2 N＋離子注入劑量對(duì)菌株突變率的影響

N＋離子注入后，每個(gè)劑量隨機(jī)挑取150個(gè)單菌落與稻瘟病菌進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，并設(shè)出發(fā)菌株BS501a作對(duì)照。離子注入劑量與菌體突變率之間的關(guān)系如表1所示。

表1 不同N＋注入劑量對(duì)突變率的影響

離子注入劑量與供試菌株的存活率和突變率有一定關(guān)系。在低注入劑量水平（5×1014～30×1014N＋／cm2），菌株存活率較高，負(fù)突變率高于正突變率；隨著注入劑量的升高，存活率明顯下降，負(fù)突變率降低，正突變率升高；而在注入劑量為30×1014N＋／cm2時(shí)，菌株BS501a的總突變率最高，為77.85%，其中正突變率在所有注入劑量中最高，為36.71%，為離子注入的最佳處理劑量；當(dāng)注入劑量高于這一水平時(shí)，除存活率略有回升外，正突變率和負(fù)突變率均下降，正突變率高于負(fù)突變率。因此選用30×1014N＋／cm2作為二次誘變的劑量。

當(dāng)注入劑量為30×1014～50×1014N＋／cm2時(shí)，正突變率（34.09%～36.71%）較高，同時(shí)負(fù)突變率（30.05%～33.12%）也較高，而該劑量范圍恰好對(duì)應(yīng)在“馬鞍區(qū)”。此結(jié)果與文獻(xiàn)［7］所報(bào)道的“在馬鞍區(qū)域菌株最易發(fā)生突變”相一致。

2.1.3 初選突變株拮抗穩(wěn)定性

將經(jīng)N＋注入誘變處理后得到的7株拮抗活性較高的菌株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究，以正突變幅度（拮抗活性提高率）的穩(wěn)定性作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。正突變幅度＝（正突變株拮抗帶寬度－BS501a菌株拮抗帶寬度）／BS501a菌株拮抗帶寬度×100%。結(jié)果如表2所示：有5株菌株在連續(xù)傳3代以后正突變幅度明顯下降，即發(fā)生了回復(fù)突變；BSA498在連續(xù)傳至第5代時(shí)，正突變幅度也明顯下降；只有菌株BSA139的正突變幅度下降（即回復(fù)突變）較慢，對(duì)這一株菌株進(jìn)行離子束二次誘變。

表2 初選突變株多代培養(yǎng)正突變幅度的變化1）

2.2 再次離子注入誘變

將突變菌株BSA139進(jìn)行二次誘變，注入劑量為30×1014N＋／cm2，其他條件同第1次N＋離子注入誘變。誘變樣品的處理、篩選和正突變幅度穩(wěn)定性試驗(yàn)均同第1次離子注入誘變。突變株篩選和正突變幅度計(jì)算所用對(duì)照為BS501a菌株。誘變結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，經(jīng)第2次N＋離子束誘變后，突變株正突變幅度并未提高，遺傳穩(wěn)定性也未明顯提高。從誘變后的突變株中篩選出一株拮抗活性和遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較高的突變株BSB253，對(duì)這一株菌株再進(jìn)行60Coγ射線(xiàn)誘變。

表3 二次N＋離子注入高活性正突變株多代培養(yǎng)突變幅度的變化1）

2.3 60Coγ射線(xiàn)誘變

將離子束二次誘變后得到的突變株BSB253進(jìn)行60Coγ射線(xiàn)照射。突變株的篩選方法與離子束注入誘變篩選方法一致，并設(shè)BS501a菌株作對(duì)照。經(jīng)篩選得到5株拮抗活性較高的復(fù)合誘變突變株（表4）。用SPSS16.0進(jìn)行方差分析（LSD法），判斷差異顯著性（α＝0.05）。

表4 復(fù)合誘變突變菌株的拮抗活性1）

2.4 復(fù)合誘變突變株拮抗穩(wěn)定性

將經(jīng)復(fù)合誘變處理后得到的5株拮抗活性較高的菌株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。以正突變幅度的穩(wěn)定性作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，BS501a經(jīng)復(fù)合誘變后，正突變幅度雖然有所下降，但遺傳穩(wěn)定性均有不同程度提高，其中BSC45傳至第5代時(shí)，遺傳穩(wěn)定性依然保持在88.3%。

表5 復(fù)合誘變突變株多代培養(yǎng)正突變幅度的變化

由表5可以看出，BSC45菌株各代拮抗穩(wěn)定性最好，各代突變株與稻瘟病菌對(duì)峙培養(yǎng)，拮抗帶寬度平均為7.5mm，比出發(fā)菌株BS501a拮抗帶寬6.05mm提高了24%。

2.5 突變株BSC45抗菌譜測(cè)定

黃瓜鐮刀菌和禾生腐霉由于生長(zhǎng)比較快，12h即可長(zhǎng)半皿，而枯草芽胞桿菌發(fā)酵液的抗菌活性成分在培養(yǎng)8h后開(kāi)始產(chǎn)生，48h達(dá)到最高峰［8］。為準(zhǔn)確判斷BSC45的抑菌效果，采用先在新鮮PDA平板四周接種BSC45單菌落，26℃培養(yǎng)24h后，在平板中央接種受試真菌菌餅，繼續(xù)培養(yǎng)72h，對(duì)峙培養(yǎng)效果如表6所示。

表6 BSC45對(duì)2株生長(zhǎng)快速的植物病原菌的抑制作用1）

小麥赤霉病菌、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、玉米小斑病菌、黃瓜灰霉病菌、玉米青枯病菌、玉米串珠鐮孢等生長(zhǎng)速度中等?？莶輻U菌BSC45對(duì)這些病原真菌的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，采用在新鮮PDA平板中央移入直徑5mm受試真菌菌餅，并呈對(duì)角線(xiàn)在菌餅四周接高抗誘變株，26℃培養(yǎng)72h，對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 BSC45對(duì)10株生長(zhǎng)中速的植物病原菌的抑制作用

小麥紋枯病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌生長(zhǎng)較為緩慢，如與枯草芽胞桿菌一起接種，則培養(yǎng)72h后病原真菌直徑比較小，影響拮抗帶寬度測(cè)量的準(zhǔn)確性。因此采用在新鮮PDA平板中央移入直徑為5mm的受試真菌菌餅，26℃培養(yǎng)24h后，在平板上呈對(duì)角線(xiàn)接種BSC45突變株，繼續(xù)培養(yǎng)72h。對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

表8 BSC45對(duì)4株生長(zhǎng)緩慢的植物病原菌的抑制作用

以拮抗帶寬度4.25mm為臨界點(diǎn)，拮抗帶寬度大于4.25mm為抑制效果強(qiáng)，拮抗帶寬度小于4.25mm為抑制作用弱。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明BSC45對(duì)小麥根腐病菌、辣椒枯萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、黃瓜鐮刀菌、小麥紋枯病菌、玉米小斑病菌、番茄早疫病菌、黃瓜灰霉病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌的抑制效果強(qiáng)，對(duì)玉米青枯菌、玉米串珠鐮孢菌、禾生腐霉的抑制效果較弱。試驗(yàn)結(jié)果顯示枯草芽胞桿菌突變株BSC45在植物真菌病害的生物防治中具有重要意義。

3 結(jié)論和討論

在考察離子注入對(duì)枯草芽胞桿菌的存活率、總突變率、正突變率和負(fù)突變率等影響的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)確定了BS501a的離子注入誘變的適宜誘變劑量為30×1014N＋／cm2。通過(guò)第1次離子束誘變后，細(xì)菌拮抗活性穩(wěn)定性不太好，因此用篩選到的適宜誘變劑量進(jìn)行了二次誘變和60Coγ射線(xiàn)誘變。通過(guò)多次篩選、拮抗活性穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終獲得1株拮抗活性遺傳穩(wěn)定的菌種BSC45，與稻瘟病菌對(duì)峙培養(yǎng)，拮抗帶寬比出發(fā)菌株BS501a提高了24%。

利用物理和化學(xué)方法得到的突變菌株，容易發(fā)生回復(fù)突變，必須經(jīng)過(guò)多次傳代驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性。作者在試驗(yàn)中所獲得的突變株中就存在著幾株回復(fù)突變的菌株，最后經(jīng)過(guò)多次傳代和驗(yàn)證試驗(yàn)，證實(shí)經(jīng)N＋離子注入和60Coγ射線(xiàn)復(fù)合誘變獲得的突變菌株BSC45的穩(wěn)定性較好。作為試驗(yàn)菌株，與單因素誘變相比，復(fù)合誘變有其特有優(yōu)勢(shì)。從研究結(jié)果可以看出，首次離子束誘變后，雖然獲得了拮抗活性提高36%的突變株，但拮抗活性的遺傳穩(wěn)定性較差。進(jìn)行第2次離子束誘變后，拮抗活性和遺傳穩(wěn)定性并未提高，可能是因?yàn)橹貜?fù)使用同一種誘變手段使菌株發(fā)生誘變耐受造成的。當(dāng)選用60Coγ射線(xiàn)進(jìn)行復(fù)合誘變后，盡管突變株的正突變幅度有所下降，但遺傳穩(wěn)定性明顯提高，可能是60Coγ射線(xiàn)的照射使由N＋注入引起的突變位點(diǎn)得以穩(wěn)定遺傳。

一般情況下，復(fù)合誘變優(yōu)于單因素誘變，篩選到目的菌株的概率相對(duì)較大［1］。本文的試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。選用誘變機(jī)制不同的誘變劑進(jìn)行復(fù)合誘變，由于誘變劑在基因上的作用位點(diǎn)不同，獲得突變株的幾率提高，誘變效果會(huì)更好。因此，采用不同誘變作用機(jī)制的物理和化學(xué)誘變劑進(jìn)行復(fù)合誘變對(duì)提高突變率、獲得合適菌株幾率較大［9－10］。但是，復(fù)合誘變有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)例外，誘變效果不一定比單一誘變效果好，如王連峰［11］比較了紫外線(xiàn)和氯化鋰復(fù)合誘變與離子束誘變選育阿魏菇多糖高產(chǎn)菌株的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紫外線(xiàn)和氯化鋰復(fù)合誘變不僅沒(méi)有提高阿魏菇多糖生產(chǎn)菌出發(fā)菌株的菌絲體多糖產(chǎn)量，反而使出發(fā)菌株的菌絲體多糖產(chǎn)量大幅減少，紫外線(xiàn)和氯化鋰復(fù)合誘變?cè)谔岣叨嗵呛可袭a(chǎn)生了一定的負(fù)向效應(yīng)。這說(shuō)明誘變育種是一項(xiàng)復(fù)雜的科研工作，存在一定的偶然性。

試驗(yàn)證實(shí)枯草芽胞桿菌突變株BSC45對(duì)多種真菌有抗菌作用，是一株很有潛力的生防菌株，在生防菌劑和生物有機(jī)肥生產(chǎn)及抗真菌基因來(lái)源方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 鄒曉，蓋棟梁，孫嘉龍，等.紫紅曲霉的復(fù)合誘變及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：78-81.

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Multiplex mutation isolates ofBacillus subtilisBS501a and the antimicrobial spectrum

Li Ruifang1， Zhao Yufeng1， Yang Shiqing2， Yi Yanjie1， Tian Yangyuan1
（1.School of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou450001，China；2.Institute of Isotopes Co.Ltd.，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou450052，China）

［Objective］To promote the biological control effects ofBacillus subtilisBS501a by multiplex mutation.［Method］The initial antagonistic strain BS501a was treated by N＋ions implantation and60Coγ-irradiation.［Result］Five mutants were screened after multiplex mutation.Genetic stability of the mutant BSC45 remained to be 88.3%after being cultured for 5 generations.The average width of inhibition zones of the mutants againstMagnaporthe griseawas 7.5 mm.There was a 1.24-fold increase as compared with the control strain BS501a.The antimicrobial spectrum of BSC45 was studied using antagonistic experiments.The results showed that the mutant BSC45 had a broad-spectrum antagonistic activity.［Conclusion］The isolateBacillus subtilisBSC45，with antagonistic activity to many different fungi，was a promising biocontrol isolate.

N＋ion implantation；60Coγirradiation； multiplex mutation； antagonistic activity； antimicrobial spectrum

S 476

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.015

2010-11-02

2010-12-01

河南省教育廳自然科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2010A210003）；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（0910SGYS34370-2）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃

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