姜 帆, 劉佳琪, 李志紅**, 吳佳教, 趙 朔

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193; 2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣州 510623)

基于DNA條形碼的廣西苦瓜中實(shí)蠅幼蟲(chóng)分子鑒定研究*

姜 帆1, 劉佳琪1, 李志紅1**, 吳佳教2, 趙 朔1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193; 2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣州 510623)

實(shí)蠅是多種熱帶、亞熱帶水果和蔬菜的重要害蟲(chóng),其卵、幼蟲(chóng)、蛹難以通過(guò)形態(tài)特征進(jìn)行種類鑒定。DNA條形碼是近年來(lái)出現(xiàn)的物種分子鑒定技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)昆蟲(chóng)非成熟蟲(chóng)態(tài)的快速鑒定。本研究利用DNA條形碼技術(shù)和BOLD系統(tǒng),選取線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因片段,針對(duì)采自于廣西南寧地區(qū)苦瓜中的實(shí)蠅幼蟲(chóng)樣品進(jìn)行了序列測(cè)定、比對(duì)和分析。結(jié)果顯示,在所檢測(cè)的10頭實(shí)蠅幼蟲(chóng)樣品中,有4頭為瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]、6頭為南亞果實(shí)蠅[Bactrocera tau(Walker)]。

實(shí)蠅; 幼蟲(chóng); DNA條形碼;COI基因; 分子鑒定

*致 謝: 感謝廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局李偉豐、李樹(shù)慶、龔秀澤等在樣品采集過(guò)程中給予的大力支持。

**通信作者 Tel:010-62733000;E-mail:lizh@cau.edu.cn第1作者與第2作者對(duì)本文為同等貢獻(xiàn)

實(shí)蠅是重要的果蔬害蟲(chóng)之一,也是國(guó)際上重要的檢疫性害蟲(chóng),近年來(lái)口岸截獲的實(shí)蠅數(shù)量和批次有大幅上升的趨勢(shì)[1]。廣西地處亞熱帶,生態(tài)環(huán)境復(fù)雜,與相鄰東盟國(guó)家的果蔬貿(mào)易頻繁,給實(shí)蠅的傳播提供了有利條件,控制實(shí)蠅蔓延已經(jīng)是當(dāng)?shù)刂矙z工作的重要課題。2000-2004年廣西檢驗(yàn)檢疫局組織各口岸局開(kāi)展了全區(qū)實(shí)蠅檢測(cè)工作,4年多來(lái)共設(shè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)1 940個(gè),連續(xù)采集了廣西不同地區(qū)、不同季節(jié)和不同寄主環(huán)境下的實(shí)蠅25萬(wàn)頭。經(jīng)鑒定,共有橘小實(shí)蠅等26種,其中橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅3個(gè)種是廣西的優(yōu)勢(shì)種,發(fā)生普遍,數(shù)量也較多,基本分布于全區(qū)各地[2]。

傳統(tǒng)的物種鑒定工作主要依靠形態(tài)學(xué)特征,但由于區(qū)分不同實(shí)蠅種類之間的形態(tài)學(xué)差別往往非常細(xì)微和復(fù)雜,僅有少數(shù)專家能夠?qū)﹃P(guān)系緊密、親緣較近的實(shí)蠅種類進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。同時(shí),由于口岸截獲的實(shí)蠅很多情況下并非成蟲(chóng),不表現(xiàn)種水平的區(qū)分特征,只有等培養(yǎng)成熟后才能被準(zhǔn)確鑒定[3],極大地降低了檢疫工作的時(shí)效性。

近年來(lái),隨著DNA檢測(cè)和分析技術(shù)的快速發(fā)展,各種分子生物學(xué)手段被廣泛應(yīng)用于實(shí)蠅的種類鑒定,如RFLP、AFLP以及DNA測(cè)序等[4],而通過(guò)測(cè)定某個(gè)或某幾個(gè)基因的部分序列來(lái)進(jìn)行種類鑒定和區(qū)分的DNA條形碼(DNA barcode)技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展和使用[5]。這一技術(shù)可以讓非專業(yè)人員在很短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行鑒定[6]。線粒體DNA上的細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因的100～650 bp被證實(shí)能對(duì)很多動(dòng)物物種進(jìn)行高效區(qū)分[7],是進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定的首選目的基因。

BOLD(the barcode of life data)系統(tǒng)是為DNA條形碼的獲得、儲(chǔ)存、分析及發(fā)表提供幫助的信息平臺(tái)(http:∥www.boldsystems.org/views/login.php)。通過(guò)整合生物分子、形態(tài)、區(qū)域分布的數(shù)據(jù),該系統(tǒng)在各類生物信息之間建立了聯(lián)系。用戶通過(guò)BOLD可以在全球基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中免費(fèi)獲得DNA條形碼序列[8]。BOLD系統(tǒng)目前記錄了動(dòng)物界、植物界、真菌界、原生生物界共118 204種生物的DNA條形碼,其中記錄的517種實(shí)蠅科昆蟲(chóng)中,Dacinae亞科、Tephritinae亞科和Trypetinae分別占197、195種和113種,在Dacinae亞科中,Bactrocera、Ceratitis和Dacus為記錄較多的3個(gè)屬,分別為 83、34、50種。

本研究應(yīng)用 DNA條形碼分子鑒定技術(shù),對(duì)2009年采自于廣西南寧地區(qū)苦瓜果實(shí)中的實(shí)蠅幼蟲(chóng)樣品進(jìn)行了mtDNACOI基因片段的序列檢測(cè),與BOLD系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行了比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析,并得到了分子鑒定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品

本研究所用實(shí)蠅試材采自于廣西壯族自治區(qū)南寧地區(qū)一苦瓜菜園的多個(gè)苦瓜果實(shí),通過(guò)剖果采集。實(shí)蠅幼蟲(chóng)樣品共計(jì)10頭,采集后液浸于100%的乙醇中并低溫保存。

1.2 成蟲(chóng)誘集

本研究采用廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局提供的誘捕器和誘餌對(duì)上述地區(qū)的實(shí)蠅成蟲(chóng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Steiner式誘器中添加橘小實(shí)蠅引誘劑(Me)或瓜實(shí)蠅引誘劑(Cue),每個(gè)誘捕器為一種引誘劑;Mcphail式誘器中加蛋白誘餌。

1.3 DNA提取

依據(jù)李云龍[9]方法,采用天根生化科技(北京)有限公司的“血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒”,進(jìn)行實(shí)蠅幼蟲(chóng)總DNA的提取。

1.4 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

擴(kuò)增的目的片段是mtDNA中COI基因總長(zhǎng)度為615 bp的一段序列,擴(kuò)增引物參考Folmer所使用的LCO-1490和HCO-2198[10],由北京奧科生物科技有限公司合成,信息如表1所示。

表1 引物序列信息

PCR 反應(yīng)的總體積為52 μ L,具體包含:6.0 μ L 10 ×buffer緩沖液,3.0 μ L MgCl2,2.0 μ L dNTPS,0.4 μ LTaqDNA 聚合酶 ,上下游引物各 3.0 μ L,ddH2O 32.6μ L,DNA 模板 2.0 μ L。反應(yīng)條件為94℃加熱3 min,然后進(jìn)行39次PCR循環(huán):94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物保存于4℃。2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,EB染色檢測(cè)。

委托北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行純化并進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序均在ABI-3730測(cè)序儀上進(jìn)行。

1.5 序列比對(duì)和分析

雙向序列返回后,由DNAMAN軟件對(duì)每一樣品正反向測(cè)序的結(jié)果拼接,得到單條準(zhǔn)確序列。然后在BOLD(barcode of life date systems v2.5)數(shù)據(jù)庫(kù)中的identify specimen功能進(jìn)行相似性比對(duì),以確定所擴(kuò)增的615 bp序列的種群,然后查看鑒定結(jié)果(identification summary)以及相似性數(shù)據(jù)(distance summary),最后利用PAUP 4.0軟件采用最大似然法(ML)、鄰接法(NJ)和簡(jiǎn)約法(MP)構(gòu)建所檢測(cè)的10個(gè)實(shí)蠅樣品與BOLD、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種實(shí)蠅的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),以核實(shí)確定鑒定的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 成蟲(chóng)誘集結(jié)果

所誘集到的成蟲(chóng)全部為瓜實(shí)蠅和南亞果實(shí)蠅。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后含有615 bp特異片段的PCR粗產(chǎn)物,結(jié)果如圖1所示,其中第1泳道為Marker,第11泳道為陰性對(duì)照。

圖1 實(shí)蠅幼蟲(chóng)COI基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 序列測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過(guò)正反向拼接、同物種序列比對(duì)和手工校正,最終得到了長(zhǎng)度為615 bp的高質(zhì)量COI序列10條。

2.4 相似性比對(duì)鑒定結(jié)果

經(jīng)BOLD的分子鑒定結(jié)果為:瓜實(shí)蠅有4頭,對(duì)應(yīng)上述PCR擴(kuò)增結(jié)果的第4、5、7、8泳道,與 BOLD中 瓜 實(shí) 蠅 GBDP1754-06、GBDP2095-06、GBDP2100-06、GBDP2095-06比對(duì)的相似性分別為100%、100%、99.84%、100%;南亞果實(shí)蠅為 6頭,對(duì)應(yīng)上述PCR 擴(kuò)增結(jié)果的第2、3、6、9、10、12泳道,與BOLD中南亞果實(shí)蠅MVTBI310-09的相似性分別為 100%、100%、100%、99.66%、99.83%、100%。

圖2 ML法構(gòu)建的未知種及其相關(guān)種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將相似度非100%的第7、第 9、第10泳道的序列提交GenBank,獲得注冊(cè)號(hào)分別為:HM590447、HM590448、HM590449。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用PAUP 4.0軟件,分別采用最大似然法、鄰接法和簡(jiǎn)約法構(gòu)建各條序列與BOLD、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分屬各物種的個(gè)體的聚集趨勢(shì)十分顯著,這表明同一物種的個(gè)體可以和其他物種的個(gè)體很好地區(qū)分開(kāi),而結(jié)果也驗(yàn)證了前面分子鑒定的結(jié)論。

2.6 結(jié)論

通過(guò)分子鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的確認(rèn),從苦瓜果實(shí)中提取的10頭實(shí)蠅幼蟲(chóng)為南亞果實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅共存,其中南亞果實(shí)蠅6頭,瓜實(shí)蠅4頭。所鑒定的實(shí)蠅幼蟲(chóng)種類與本試驗(yàn)的成蟲(chóng)誘捕結(jié)果相吻合,同時(shí)也與當(dāng)?shù)氐膶?shí)蠅優(yōu)勢(shì)種群及寄主一致[2,11]。

3 討論

通過(guò)進(jìn)行線粒體DNA上COI基因615 bp序列的測(cè)定和比較分析,廣西南寧苦瓜園苦瓜果實(shí)中采集的實(shí)蠅幼蟲(chóng)得到了成功的鑒定和區(qū)分。因此本研究得到的序列完全可以作為DNA Barcode序列補(bǔ)充進(jìn)入BOLD系統(tǒng),同時(shí)本研究在今后也完全可以應(yīng)用于一線口岸的實(shí)際檢疫工作中,這種方法的推廣在保證物種鑒定準(zhǔn)確性的同時(shí),將大大降低非成蟲(chóng)態(tài)對(duì)象在實(shí)際工作中的檢疫難度,提高通關(guān)效率。同時(shí),本研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了基于COI基因的可變位點(diǎn)特征,615 bp甚至更短的片段序列即可以對(duì)物種達(dá)到區(qū)分效果[12],從而實(shí)現(xiàn)有關(guān)物種的快速、準(zhǔn)確鑒定。

在使用BOLD系統(tǒng)的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的時(shí)候,我們也發(fā)現(xiàn)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)部分物種和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果不一樣的位置。這說(shuō)明barcode并不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育分析,利用BOLD系統(tǒng)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以作為分子鑒定的補(bǔ)充,但并不能直接視為相應(yīng)物種在進(jìn)化上的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,這和之前的很多研究結(jié)果是一致的[13]。

各種DNA分子標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于親子鑒定和個(gè)體識(shí)別領(lǐng)域[14],在實(shí)蠅分子鑒定領(lǐng)域也有了許多應(yīng)用和進(jìn)展[15]。本研究的思路在今后的檢疫工作中同樣具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值,相信隨著中文實(shí)蠅條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)的進(jìn)一步研究以及有關(guān)物種線粒體DNACOI基因序列的進(jìn)一步積累,最終將幫助我們實(shí)現(xiàn)實(shí)蠅種群更加快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的分子鑒定。

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Molecular identification of fruit fly larvae by DNA barcodes

Jiang Fan1, Liu Jiaqi1, Li Zhihong1, Wu Jiajiao2, Zhao Shuo1
(1.College of Agronomy and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing100193,China;2.Inspection and Quarantine Technology Center,GuangdongEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510623,China)

Fruit fly(Diptera:Tephritidae)is an important pest of a variety of tropical and subtropical fruits and vegetables,while species identification at its egg,larvae and adult stages is difficult by morphological characteristics.Emerging as a promising molecular technology of species identification,DNA barcodes can realize rapid identification of the immatures.Based on the DNA barcoding and BOLD system,a series of studies,including sequencing,alignment and analysis,were conducted based on the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I(COI)gene using fruit fly larvae samples collected from balsam pear in Guangxi.The results showed that four of the ten larval specimens wereBactrocera cucurbitae(Coquillett),and six of them areBactrocera tau(Walker).

fruit fly; larva; DNA barcode;COIgene; molecular identification

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.033

2010-05-25

2010-06-31

農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”項(xiàng)目(2009-Z41);國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(200903034);國(guó)家自然科學(xué)基金(30771432)