翟曉翔 ，姜月華，嚴(yán)月華 ，唐志銘 ，李敬果 ，孫敬昌，張翠俠 ，陳向輝

（1.江蘇省徐州市中醫(yī)院，徐州 221003；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011；3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250355）

白黎蘆醇對(duì)人表皮樣癌細(xì)胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影響

翟曉翔1，姜月華2，嚴(yán)月華3，唐志銘1，李敬果1，孫敬昌4，張翠俠1，陳向輝1

（1.江蘇省徐州市中醫(yī)院，徐州 221003；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011；3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250355）

目的 觀察白藜蘆醇誘導(dǎo)人表皮樣癌A431細(xì)胞的凋亡情況，并探討其對(duì)端粒酶活性和hTERT基因蛋白表達(dá)的影響。方法 以不同濃度的白藜蘆醇處理A431細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；采用TRAP-PCR-ELISA法測(cè)定A431細(xì)胞的端粒酶活性；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)A431細(xì)胞hTERT蛋白水平。結(jié)果 在白藜蘆醇誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡的過程中對(duì)端粒酶活性有顯著抑制作用，且隨著其濃度增加而抑制作用越強(qiáng)；白藜蘆醇能降低A431細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性。結(jié)論 白藜蘆醇能下調(diào)hTERT蛋白表達(dá)，抑制A431細(xì)胞端粒酶活性，這可能是白藜蘆醇抑制A431細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。

白藜蘆醇；A431細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；增殖；端粒酶

白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，具有多種生物學(xué)活性及藥理作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)它可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，因此具有抗腫瘤的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇的抗腫瘤作用與其抑制端粒酶活性有關(guān)[1，2]。端粒酶是一種特異的染色體末端轉(zhuǎn)移酶，研究發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中均能檢測(cè)到明顯的端粒酶活性，而正常細(xì)胞中則檢測(cè)不到。正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中大多伴隨端粒酶的激活[3]，端粒酶的活化是惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其中催化亞單位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）與端粒酶的激活密切相關(guān)，二者呈正相關(guān)[4，5]。目前白藜蘆醇誘導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞凋亡及對(duì)其端粒酶活性的影響研究比較少見。為此，我們應(yīng)用白藜蘆醇對(duì)體外培養(yǎng)的人表皮樣癌A431細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)A431細(xì)胞增值、凋亡及端粒酶活性的影響，為白藜蘆醇應(yīng)用于臨床治療皮膚腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白藜蘆醇 購自Alexis Biochemicals公司。

1.1.2 A431細(xì)胞株 武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基：美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶粉（Trypsin）、DMSO：均為 Amresco公司；TRAP-PCR-ELISA端粒酶活性檢測(cè)試劑盒：Roche（德國寶靈曼公司）。

1.1.4 主要儀器 自動(dòng)酶標(biāo)記數(shù)儀：Elx808型，美國BioTek儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀：ABI Veriti 96孔型梯度PCR擴(kuò)增儀，美國基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A431細(xì)胞以1×107mL接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長滿時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組與給藥 取第4代對(duì)數(shù)生長期的A431細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，以2×104/mL濃度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)24h無血清培養(yǎng)基預(yù)處理后，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（A組）和3個(gè)藥物濃度組，即B組（濃度0.1mg/mL）、C 組 （濃 度 0.2mg/mL）、D 組 （濃 度0.3mg/mL），每組8個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 按前述分組加藥培養(yǎng)24h后，細(xì)胞在96孔板上用4%多聚甲醛室溫(RT)固定30min，蒸餾水洗凈甲醛，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察A431細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 MTT法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇干預(yù)下的A431細(xì)胞增生狀況 將白藜蘆醇用DMSO溶解為所需濃度，分別加入上述3個(gè)藥物濃度組，每孔20μL，空白對(duì)照組每孔加入1%DMSO/DMEM20μL。藥物干預(yù)24h，每孔加入5mg/mLMTT（用Ph7.4PBS配制）20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩l0min，使甲臜結(jié)晶顆粒溶解為均勻的藍(lán)紫色，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀波長490nm處測(cè)定各孔吸光度（A）值。

1.2.5 白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞端粒酶活性的影響 將白藜蘆醇用DMSO溶解為所需濃度，分別加入上述3個(gè)藥物濃度組，每孔20μL，空白對(duì)照組每孔加入1%DMSO/DMEM20μL。37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法收集細(xì)胞，每個(gè)反應(yīng)取2×105細(xì)胞移入一個(gè)新的EP管中，按TRAP-PCR-ELISA端粒酶活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀測(cè)量在690nm參考波長的450nm波長吸光度（A）值，根據(jù)A=A450nm-A690nm計(jì)算，A值代表端粒酶活性。

1.2.6 白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞hTERT蛋白水平的影響 采用Western blot法（蛋白質(zhì)印跡法）檢測(cè)。按前述分組與給藥，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗2次，加入細(xì)胞裂解液，在冰面上靜置10～20 min，用細(xì)胞刮勻漿后，4℃，離心 10min，轉(zhuǎn)速 15 000 r/min，取上清，加入1/3體積的4×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性。樣品蛋白經(jīng)凝膠電泳分離、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h后加入hTERT單克隆抗體（1:500），4℃孵育過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:500），37%孵育1 h，漂洗后用ECL顯色，曝光，沖洗膠片。將hTERT蛋白條帶與內(nèi)對(duì)照β-actin蛋白條帶的密度灰度值的比值作為蛋白的表達(dá)相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇誘導(dǎo)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 白藜蘆醇(B、C、D)作用A431細(xì)胞24h后，相差顯微鏡下可見不同程度的凋亡特征，表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁不好，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)中顆粒明顯增多，細(xì)胞核固縮，有的出現(xiàn)核碎裂，可見凋亡小體，部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。這種作用隨白藜蘆醇濃度的增加而增強(qiáng)；而對(duì)照組（A）細(xì)胞貼壁牢，生長良好，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)中顆粒很少，未見凋亡小體。見圖1。

2.2 白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響 以不同濃度的白藜蘆醇處理A431細(xì)胞后，采用MIT法檢測(cè)其增殖情況，結(jié)果顯示，各不同藥物濃度組與空白對(duì)照組相比，A值均明顯偏低，有顯著性差異（P<0.01），說明白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，并且這種抑制作用有劑量依賴性，見表1。

表1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

表1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

注：與空白對(duì)照組比較；**P＜0.01。

組別A組B組C組D組濃度-0.1mg/mL 0.2mg/mL 0.3mg/mL A值0.485±0.050 0.228±0.018*0.177±0.016*0.155±0.008*

2.3 白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞端粒酶活性的影響 見表2。白藜蘆醇作用24h，A431細(xì)胞的端粒酶活性與未加藥的對(duì)照組相比受到顯著抑制（P<0.01），且隨藥物濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞端粒酶活性的影響（±s，n=6）

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞端粒酶活性的影響（±s，n=6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別A組B組C組D組濃度-0.1mg/mL 0.2mg/mL 0.3mg/mL端粒酶活性0.719±0.064 0.623±0.068*0.608±0.057**0.506±0.043**

2.4 白藜蘆醇對(duì)A431細(xì)胞hTERT蛋白水平的影響 以不同濃度的白藜蘆醇處理A431細(xì)胞24h后，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hTERT蛋白水平明顯降低。由Matlab圖像軟件分析了空白對(duì)照組和白藜蘆醇組相對(duì)灰度值，0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL 3個(gè)濃度組的灰度值均低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

皮膚癌為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性增生，主要包括鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌[6]。近年來皮膚癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，這可能與環(huán)境污染等因素造成臭氧層被破壞，到達(dá)地球的紫外線增多，從而人被動(dòng)接受其照射的強(qiáng)度增高有關(guān)[7]。目前皮膚癌的具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，臨床治療皮膚癌的方法也有限,尋找一種新的有效的防治皮膚癌的天然藥物就成為當(dāng)前亟待解決的課題之一。近年來隨著對(duì)白藜蘆醇研究的深入，發(fā)現(xiàn)它對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有拮抗作用，如肝癌、胃癌、白血病、食管癌、乳腺癌、宮頸癌等[8]，其機(jī)制可能與端粒酶活性改變有關(guān)[9]。但白藜蘆醇是否也對(duì)皮膚癌細(xì)胞的增值、凋亡及端粒酶活性產(chǎn)生影響，目前國內(nèi)外尚無這方面的研究報(bào)道，因此，我們通過本項(xiàng)研究對(duì)此進(jìn)行了一些探索，為白藜蘆醇臨床治療皮膚癌提供理論依據(jù)。

端粒是一種封閉真核染色體末端的脫氧核糖核酸，對(duì)染色體起保護(hù)作用。端粒酶是一種特異的染色體末端轉(zhuǎn)移酶，其主要功能是以自身的RNA為模板，催化合成染色體末端的端粒重復(fù)序列，彌補(bǔ)因細(xì)胞分裂而致的端粒DNA的丟失，使細(xì)胞無限增殖，它的表達(dá)水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性異常表達(dá)，而在正常人體細(xì)胞中檢測(cè)不到端粒酶活性。端粒酶活化是惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它的活性可以通過調(diào)控端粒酶的RNA成分或 (和)蛋白質(zhì)成分來實(shí)現(xiàn)，其中催化亞單位hTERT作用最為重要[10]。

本項(xiàng)研究通過白藜蘆醇干預(yù)A431細(xì)胞后，在形態(tài)學(xué)上可見典型的凋亡特征。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度白藜蘆醇干預(yù)后，A431細(xì)胞的增殖都受到一定程度的抑制，其抑制作用隨著白藜蘆醇濃度增加而增強(qiáng)，表明這種抑制作用有一定的劑量依賴。端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇能抑制A431細(xì)胞端粒酶活性，且與濃度呈依賴關(guān)系。以不同濃度的白藜蘆醇處理A431細(xì)胞24h后，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hTERT蛋白水平明顯降低。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠抑制人表皮樣癌細(xì)胞A431的增值，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄降低其蛋白的表達(dá)，從而降低端粒酶的活性有關(guān)。

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EffectsofResveratrolontheProliferation,ApoptosisandtheTelomeraseActivityofHumanEpidermoidCarcinomaCell

ZHAI Xiao-xiang1,JIANG Yue-hua2,YAN Yue-hua3,TANG Zhi-ming1,LI Jing-guo1,SUN Jing-chang4,ZHANG Cui-xia1,CHEN Xiang-hui1
1.Chinese Medicine Hospital of Xuzhou City,Xuzhou221003,China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Ji’nan250011,China;3.Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan430071,China;4.School of Basic Medicine Cell Biology Laboratory of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Ji’nan250355,China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on cell apoptosis,ability of telomerase and the hTERT protein expression of human epidermoid carcinoma cell A431.MethodsA431 cells were treated with different concentration of resveratrol.And then the cell appearance was observed by microphone;the cell proliferation was examined by MTT assay;and the ability of telomerase were detected by TRAP-PCR-ELISA.ResultsResveratrol could significantly inhibited the activity of telomerase in concentration-dependent manner,and also decreased the expression of hTERT protein in concentrationdependent manner.ConclusionResveratrol can down-regulate the expression of hTERT protein,and also inhibit the activity of telomerase of A431.It may be one of the important mechanisms that resveratrol could inhibit the proliferation of A431 cell.

resveratrol;A431 cell;cell apoptosis;proliferation;telomerase

R285,R739.5

A

1672－0709（2011）05-0276－04

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（XM08C048）

姜月華，E-mail：jiang_yuehua@hotmail.com

2011-08-16）