李 倩， 焦 燕， 彭 海

Gokkusu等研究表明同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可以促炎癥介質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷［1～3］，而后者是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素［4］。PPARs屬于Ⅱ型核受體配體依賴轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。近年的研究顯示，在特定配體激活下，PPARs可以抑制炎性因子表達(dá)和炎癥反應(yīng)［5～7］。羅格列酮(Rosiglitazone，Ros)是PPARγ高親和力的配體，有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。本研究旨在觀察羅格列酮是否對Hcy誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的損傷有保護(hù)作用以及對TNF-a和IL-6水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Hcy(Sigma公司);羅格列酮(浙江萬馬公司);兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體及兔抗人Caspase-3抗體(武漢博士德);兔抗人PPARγ抗體(Cell Signing Technology);兔抗人β-actin和辣根酶標(biāo)記鼠抗兔二抗(武漢博士德);TNF-α和IL-6試劑盒(武漢博士德)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 臍帶取自華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦。PBS沖洗靜脈腔，0.25%胰蛋白酶(trypsin)灌注消化(37℃，10min)，血清滅活，離心收集細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移至鋪有0.2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HUVECs培養(yǎng)液為含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞融合90%以上時(shí)用0.25g/L胰酶消化傳代，第2～3代用做實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及處理 HUVECs分為對照組(A組，DMEM培養(yǎng)基);實(shí)驗(yàn)組(B組，Hcy 100μmol/L);干預(yù)組(C組，Ros)，再根據(jù)不同濃度分為(C1:Hcy 100μmol/L+Ros10nmol/L)，(C2組:Hcy 100μmol/L+Ros 20nmol/L)(C3 組:Hcy 100μmol/L+Ros 30nmol/L)，各培養(yǎng)24h和48h。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) HUVECs按每孔2×103個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組加入試劑，48h后每孔避光加入5mg/ml MTT 50u L，混合均勻后置于37℃，含5%體積分?jǐn)?shù)CO2，培養(yǎng)箱孵育4h后吸取上清液，每孔加入 DMSO 200μl，振蕩10min。采用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(波長570nm處)。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期HUVECs，按1×106/ml的密度接種于含有蓋玻片的6孔板內(nèi)進(jìn)行爬片，待細(xì)胞長至蓋玻片50%的時(shí)候，改換成用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，細(xì)胞饑餓24h，使細(xì)胞同步化于G0期。然后每組分別加入相應(yīng)的試劑，繼續(xù)培養(yǎng)分別至24及48h，用4%多聚甲醛固定，行Bax、Bcl-2、Caspase-3的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，染色步驟嚴(yán)格按SABC、DAB試劑盒說明書操作。

1.6 ELISA法檢測上清液TNF-α和IL-6水平

分別采用TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒測定，嚴(yán)格按試劑盒和酶標(biāo)儀說明操作。在酶標(biāo)儀上測定λ=450nm的TNF-α和IL-6的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液的TNF-α和IL-6水平。

1.7 Western-blot檢測 PPARγ蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞約1×106/L，加入電泳裂解緩沖液，取20μg變性裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE膜電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶封閉后，將膜置2ml稀釋好的抗PPARγ一抗體液(1∶200)，4℃ 孵育過夜，TBST液搖洗4次，每次5min。然后將膜置10ml含辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)室溫下孵育2h，再用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光、顯影、定影，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均采用±s，資料采用t檢驗(yàn)或LSD法進(jìn)行組間兩兩均數(shù)比較，以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 檢測細(xì)胞存活率 羅格列酮對100μmol/L Hcy所致的細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。隨羅格列酮濃度增加和作用時(shí)間延長，細(xì)胞存活率增加(P ＜0.05，見表1)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)分析 與Hcy組相比，羅格列酮組Caspase-3，Bax蛋白表達(dá)明顯下降，Bcl-2表達(dá)明顯增高，呈濃度和時(shí)間依賴性(P＜0.05，見表2)。

2.3 炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6水平變化 Hcy使HUVECs產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，隨著Hcy作用時(shí)間延長，TNF-α和IL-6水平增高。羅格列酮明顯降低TNF-α和IL-6水平，且具有時(shí)間及濃度依賴性(P＜0.05，見表3)。

2.4 PPARγ蛋白表達(dá)檢測 與Hcy組比較，Ros干預(yù)組(C組)PPARγ表達(dá)明顯上調(diào)，呈濃度和時(shí)間依賴性(P ＜0.05，見圖1)。

表1 羅格列酮對HUVECs存活的影響±s)

表1 羅格列酮對HUVECs存活的影響±s)

與B組相比*P＜0.05;與C1相比 #P＜0.05;與C2相比△P＜0.05;與24h相比▲P ＜0.05

組別細(xì)胞存活率(%)24h 48h A組B組C1組C2組C3組91.78 ±0.0121.34 ±0.0228.76 ±0.02*39.22 ±0.02*#52.46 ±0.01*#△91.44 ±0.0113.58 ±0.0141.22 ±0.01＊▲54.84 ±0.01*#▲63.36 ±0.01*#△▲

表2 羅格列酮對Bax、Bcl-2、Caspas-3蛋白表達(dá)的影響(%±s)

表2 羅格列酮對Bax、Bcl-2、Caspas-3蛋白表達(dá)的影響(%±s)

與B組24h相比*P＜0.05;與B組48h相比#P＜0.05;與24h相比△P＜0.05

組別Caspase Bax Bcl-2 24h 48h 24h 48h 24h 48h B C1 C3 34.63 ±1.bl_4.34 ±0.22*22.45 ±1.04*46.39 ±3.33△23.73 ±1.01#△17.97 ±0.40#△54.23 ±2.0547.09 ±1.74*41.59 ±1.11*78.58 ±3.71△45.17 ±1.35#△43.12 ±1.58#△46.004 ±1.5150.16 ±1.45*52.10 ±4.17*44.76 ±0.62△63.67 ±2.69#△76.26 ±7.39#△

表3 羅格列酮對IL-6和TNF-a表達(dá)的影響(pg/ml±s)

表3 羅格列酮對IL-6和TNF-a表達(dá)的影響(pg/ml±s)

與A 組相比*P ＜0.05;與 B 組相比#P ＜0.05;與24h相比△P ＜0.05

IL-6 TNF-a 24h 48h 24h 48h ABC 1 C2 C3 163.67 ±3.le475.00 ±5.29*227.33 ±2.52#217.00 ±5.57#200.00 ±3.61#165.00 ±4.00276.67 ±6.11＊△223.67 ± 4.51#△188.00 ± 2.65#△174.00 ± 2.65#△1.35 ±0.012.62 ±0.01*2.22 ±0.01#2.09 ±0.04#1.93 ±0.08#1.35 ±0.013.58 ±0.02＊△2.17 ±0.01#△1.71 ±0.01#△1.56 ±0.02#△

圖1 ROS不同濃度及時(shí)間對PPARγ蛋白表達(dá)的影響

3 討論

1999年Ross提出動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是動(dòng)脈壁的一種慢性炎癥反應(yīng)過程，細(xì)胞因子在涉及AS各階段的炎癥反應(yīng)事件中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Tomlinson等［8］研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是一種炎癥刺激物，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子如TNF-α和IL-6損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管炎性損傷。TNF-α是一種致炎性細(xì)胞因子，生物活性廣泛而強(qiáng)烈，不僅參與炎癥反應(yīng)過程，而且還與其它炎性因子組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通過相互誘生而互相影響生物學(xué)效應(yīng)，使機(jī)體出現(xiàn)多種病理損害。TNF-α還可作為配體作用于內(nèi)皮細(xì)胞表面的死亡受體(如TNFR1)，進(jìn)而傳遞信息進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引發(fā)凋亡［9，10］。IL-6又稱B細(xì)胞刺激因子2，動(dòng)脈粥樣硬化病灶的主要細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等都能分泌［11］。IL-6也是有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)記物，也是機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中重要成員之一，參與多種疾病的炎癥病理過程，通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活核轉(zhuǎn)錄因子-кB(NF-кB)，使炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，進(jìn)一步促使中膜的平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移、增殖并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，還導(dǎo)致更多的炎癥介質(zhì)釋放，促使更多的單核細(xì)胞聚集、浸潤，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，Hcy組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平明顯增高，并且細(xì)胞存活率下降，促凋亡的蛋白表達(dá)增加，抗凋亡蛋白表達(dá)下降，證實(shí)Hcy是炎癥反應(yīng)的刺激物，可以誘導(dǎo)HUVECs合成和分泌TNF-α和IL-6，致使HUVECs受損。

PPARs屬于Ⅱ型核受體配體依賴轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，其亞型PPARγ在參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和演變過程中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等及動(dòng)脈粥樣硬化病灶組織中均有較為廣泛表達(dá)。最近的研究表明，PPAR也可能參與炎癥調(diào)控，如抑制TNF-α，IL-6等表達(dá)。大多數(shù)研究表明PPARγ激活劑有抗炎作用［12，13］。羅格列酮是一種 PPARγ的人工合成配體激動(dòng)劑噻唑烷二酮類(TZD)降糖藥。Zhou等在基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)羅格列酮可通過調(diào)控血管內(nèi)皮炎癥，在增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性等方面發(fā)揮抗 AS作用［14］。本實(shí)驗(yàn)建立 Hcy誘導(dǎo)的 HUVECs損傷模型，用不同濃度羅格列酮進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示與Hcy組相比，羅格列酮可提高細(xì)胞的存活率;降低TNF-α和IL-6水平，呈濃度和時(shí)間依賴性;還可下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2和PPARγ蛋白表達(dá)。說明羅格列酮對Hcy誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生的TNF-α和IL-6均有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羅格列酮可保護(hù)Hcy損傷的HUVECs，其作用可能是通過降低炎癥細(xì)胞因子TNF-a和IL-6的水平，調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白水平而實(shí)現(xiàn)。研究為羅格列酮降低炎性因子TNF-α和IL-6的水平，防治動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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