范 斌， 何志義

腦梗死發(fā)病率，致殘率高，且近年來(lái)呈逐漸上升的趨勢(shì)。目前除成人卒中急性期溶栓治療外，其他治療都局限于支持治療，不能阻斷腦損傷的發(fā)生或誘導(dǎo)腦組織的再生。近年來(lái)的研究證明骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為一種非造血干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化潛能，在特定的條件下能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化，分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子、保護(hù)因子，具有神經(jīng)保護(hù)作用［1］。本實(shí)驗(yàn)擬采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療大鼠局限性腦缺血，并觀(guān)察對(duì)大鼠細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)，2月齡，Wistar大鼠45只(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供)，體重280～300g雌雄不限，隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組、鹽水對(duì)照組、股靜脈注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞組，每組動(dòng)物15只，每組又隨機(jī)分為缺血再灌注3d、7d、14d 3個(gè)亞組，每組動(dòng)物5只。另取1只Wistar大鼠，用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠抗 BrdU，兔抗大鼠ICAM-1抗體，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體(武漢博士德公司);顯微照相儀(Olypus BX，51，Japan);圖像處理軟件包(Metamorph imagin system V4.6，USA)。

1.2 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制作 采用改良Longa栓線(xiàn)法。以10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔麻醉大鼠，做頸部正中切口，分離左頸總動(dòng)脈后穿一根4號(hào)縫線(xiàn)，繼續(xù)分離頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在其動(dòng)脈夾遠(yuǎn)端和結(jié)扎之間用1ml注射針頭將頸總動(dòng)脈扎一小眼，將事先準(zhǔn)備好的魚(yú)線(xiàn)穿人(魚(yú)線(xiàn)為5cm長(zhǎng)，在2.0cm處做一標(biāo)記，尖端用砂紙磨光滑)，松開(kāi)動(dòng)脈夾，調(diào)整魚(yú)線(xiàn)的角度和方向插入頸內(nèi)動(dòng)脈，測(cè)量魚(yú)線(xiàn)尾側(cè)距離動(dòng)脈分叉處的距離，便可知插入的深度(應(yīng)為1.8～2.0cm)，用縫線(xiàn)將魚(yú)線(xiàn)固定。全部大鼠統(tǒng)一采用栓死左側(cè)大腦中動(dòng)脈并于梗死后1h再灌注。

1.3 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及BrdU標(biāo)記取2個(gè)月齡Wistar大鼠1只，腹腔注射5-氟尿嘧啶(150m/kg)，殺死部分外周血細(xì)胞，促進(jìn)骨髓增殖，48h后將大鼠處死，無(wú)菌條件下，取股骨、脛骨用FBS液清洗干凈，除去股骨近端和脛骨遠(yuǎn)端，除去另一端骨垢，用大號(hào)針頭在骨端生長(zhǎng)面開(kāi)一個(gè)小孔，用注射器將DMEM-LG培養(yǎng)液注入，收集沖洗出來(lái)的骨髓，打散組織成為細(xì)胞懸液，離心用DMEM-LG培養(yǎng)液重新懸浮沉淀的細(xì)胞，吹散后計(jì)數(shù)，按1×107接種于10%FBSw完全培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃5%二氧化碳及飽和溫度下培養(yǎng)。24h后換液去除未貼壁細(xì)胞。以后每3d換液1次，20d左右待后代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖到80%時(shí)胰酶消化傳代，取第8代之前的細(xì)胞，在接種前1d以終濃度0.1mmol/L的溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine BrdU)標(biāo)記。接種時(shí)，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度3×106/ml。

1.4 骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植 在大鼠栓塞24h，大鼠隨機(jī)分組，治療組(n=15)每只大鼠股靜脈注射1ml 3×109的骨髓基質(zhì)細(xì)胞;鹽水對(duì)照組(n=15)每只大鼠股靜脈注射1ml的生理鹽水;正常對(duì)照組(n=15)每只大鼠栓塞24h。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定骨髓基質(zhì)細(xì)胞用0.2%胰酶消化傳代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞使之成為單細(xì)胞懸液，接種于蓋玻片上培養(yǎng)過(guò)夜。次日用4%多聚甲醛固定20min，滴加血清封閉液10min，滴加一抗 CD34，CD44，CD106，37℃，60min，滴加生物素標(biāo)記第二抗體37℃，10min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化酶37℃，20min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片鏡檢。

1.6 神經(jīng)功能損害評(píng)分 采用Chen等［2］報(bào)道的神經(jīng)功能損害評(píng)分表(Neurological Severity Scores，NSS)，分別于移植前，移植后 3、7、14d 進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。分值越高代表?yè)p傷越重，評(píng)分8～12的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.7 免疫組化染色 大鼠麻醉后(量同前)，劍突下剪開(kāi)充分暴露心臟，6號(hào)輸液器刺入左心室，剪開(kāi)右心耳，輸入250ml生理鹽水，之后輸入250ml 4%多聚甲醛固定。然后斷頭取腦，腦組織去掉額極和尾極，放在固定液中儲(chǔ)存3d，以備做免疫組化分析。免疫組化采用SABC法。試劑來(lái)自武漢博士德公司。取出鼠腦切片，常規(guī)脫蠟脫水，新鮮配置3%H2O2室溫10min，切片浸0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰斷電，間隔5min，甩去多余液體。一抗為兔抗大鼠ICAM-1單克隆抗體及兔抗大鼠BrdU抗體，工作濃度(1∶100)，購(gòu)于武漢博士德公司，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，按說(shuō)明逐步操作。切片在顯微照相儀下照相(Olypus BX，51，Japan)，由圖像處理軟件包量化(Metamorph imagin system V4.6，USA)。照相部位取梗死周?chē)べ|(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞后 骨髓基質(zhì)細(xì)胞可在缺血半球大量存活，在対側(cè)半球也有少量存活。BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，在梗死半球可見(jiàn)大量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，絕大部分分布在梗死灶周?chē)瑢潅?cè)半球也可見(jiàn)少量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2 靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞顯著改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 造模后3、7、14d分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組及生理鹽水組在各時(shí)間點(diǎn)，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植組在各時(shí)間點(diǎn)，神經(jīng)功能評(píng)分均顯著低于正常對(duì)照組及生理鹽水組(P＜0.05)。并且組內(nèi)比較，在14d骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植組神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于同組3d及7d的神經(jīng)功能評(píng)分(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.3 靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞顯著抑制梗死區(qū)ICAM-1的表達(dá) 缺血后，正常對(duì)照組及生理鹽水組ICAM-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，但在缺血后各時(shí)間點(diǎn)，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞組ICAM-1表達(dá)水平經(jīng)方差分析在缺血后3d、7d較正常對(duì)照組及生理鹽水組顯著降低(P＜0.05)。14d較對(duì)照組及生理鹽水組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

表1 靜脈注射BMSCs對(duì)MACO大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響

表2 免疫組化檢測(cè)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1的表達(dá)(平均灰度值)

圖1 梗死半球BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(×400)

圖2 免疫組化檢測(cè)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1的表達(dá)(×400)

3 討論

我們的研究結(jié)果提示，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)股靜脈進(jìn)入缺血的腦組織中，這些移植的骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以存活，絕大部分分布在梗死灶內(nèi)及周邊帶并在對(duì)側(cè)大腦半球及紋狀體有少量表達(dá)。并可以顯著改善腦梗死所造成的神經(jīng)功能缺損，最重要的是我們的研究首次發(fā)現(xiàn)靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以顯著抑制ICAM-1的表達(dá)。

MSCs是骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞以外的非造血干細(xì)胞，通常也被稱(chēng)作骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞等。MSCs在體外和體內(nèi)具有多向分化潛能。特定誘導(dǎo)環(huán)境下MSCs可以向骨、軟骨、心肌、神經(jīng)元等多胚層方向分化［3］。在合適的培養(yǎng)條件下MSC可以在體外長(zhǎng)期傳代、大量擴(kuò)增，而細(xì)胞生物學(xué)特性沒(méi)有明顯改變。

我們的實(shí)驗(yàn)中用免疫化學(xué)方法鑒定骨髓基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果:CD34(－);CD44(+);CD106(－);CD34是造血細(xì)胞特異性標(biāo)志，主要分布于T B細(xì)胞，單核細(xì)胞及前體細(xì)胞的表面，骨髓基質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)。CD44及CD106在骨髓來(lái)源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞及造血干細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)，因此骨髓基質(zhì)細(xì)胞的特征為CD34(－);CD44(+);CD106(+)。

我們的結(jié)果提示靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可在缺血半球大量存活，在對(duì)側(cè)半球也有少量存活。局灶性腦缺血時(shí)，由于血腦屏障的破壞，可能有助于MSCs選擇性遷入缺血腦區(qū)。此外，缺血腦組織的炎癥等缺血相關(guān)信號(hào)也可能誘導(dǎo)和促進(jìn)MSCs的遷移。Wang等［4］研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)水平有助于MSc向缺血腦組織遷移。

本研究表明通過(guò)靜脈注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以顯著改善腦梗死所造成的神經(jīng)功能缺損。那么是什么機(jī)制或因素使移植的骨髓基質(zhì)細(xì)胞改善大腦的神經(jīng)功能，降低腦梗死的體積?目前考慮可能的作用機(jī)制為:(1)骨髓基質(zhì)細(xì)胞滲透至缺血腦組織部位，替代受損的神經(jīng)元細(xì)胞，重塑神經(jīng)傳導(dǎo)通路。(2)傳導(dǎo)通路的重建并不是神經(jīng)功能恢復(fù)的必要條件，更合理的解釋是移植的骨髓基質(zhì)細(xì)胞除可以分泌NGF、VEGF、BDNF、bFGF、HGF、CSF-1 等多種生長(zhǎng)因子;還可分泌 IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15等重要的細(xì)胞因子［5］;骨髓基質(zhì)細(xì)胞還可以合成膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)［6，7］。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)因子可能通過(guò)不同的機(jī)制，在半暗區(qū)起著神經(jīng)保護(hù)作用，減少神經(jīng)元凋亡。近年來(lái)的大量研究證明腦梗死是一個(gè)炎性反應(yīng)的過(guò)程，對(duì)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及其干預(yù)措施的研究成為腦梗死病理、生理和防治研究的熱點(diǎn)。白細(xì)胞的黏附在缺血/再灌注損傷中起重要作用，在此過(guò)程中細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)起核心作用，因此在本研究中，我們檢測(cè)了靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)ICAM-1表達(dá)的影響。ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，在體內(nèi)分布較廣。在正常情況下ICAM-1在腦組織中僅有少量表達(dá)，在腦組織受損如缺血、創(chuàng)傷及炎癥時(shí)，在內(nèi)毒素及一些細(xì)胞因子，如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素等刺激下，其表達(dá)明顯升高［8］。ICAM-1和其配體白細(xì)胞功能相關(guān)抗原LFA-1結(jié)合后能夠介導(dǎo)白細(xì)胞與靶細(xì)胞黏附，促使白細(xì)胞向缺血區(qū)聚集和浸潤(rùn)，這些聚集和浸潤(rùn)的白細(xì)胞不僅能夠直接阻斷微血管，而且還能產(chǎn)生縮血管物質(zhì)，引起血管收縮，降低血流量加重腦缺血，同時(shí)還可以釋放自由基、蛋白水解酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，導(dǎo)致缺血細(xì)胞進(jìn)一步損傷［9，10］。最近，Soriano等［11］發(fā)現(xiàn)，能表達(dá)ICAM-1的野生型小鼠腦組織梗死體積是不能表達(dá)ICAM-1的純合子小鼠腦組織梗死體積的5.6～7.8倍。應(yīng)用ICAM-1抗體亦能證實(shí)ICAM-1和白細(xì)胞在缺血腦損傷中的作用。Zhang等［12］觀(guān)察了大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞時(shí)缺血區(qū)ICAM-1單克隆抗體的作用。結(jié)果表明，應(yīng)用ICAM-1抗體組梗死體積較對(duì)照組縮小41%，白細(xì)胞的數(shù)量也顯著減少。缺血早期應(yīng)用ICAM-1抗體治療還可以延長(zhǎng)(t-PA)溶栓治療的時(shí)間窗。這說(shuō)明ICAM-1是介導(dǎo)缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因子，抑制其異常表達(dá)，可以有效的阻斷白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附過(guò)程，從而減輕再灌注的損傷程度。

本研究發(fā)現(xiàn)生理鹽水組與正常對(duì)照組之間，缺血后各時(shí)間點(diǎn)均見(jiàn)ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)，但兩組間無(wú)顯著性差異。這與 Vemuganti等［13］的研究相一致，說(shuō)明腦梗死后存在炎癥反應(yīng)。注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞組ICAM-1的表達(dá)水平經(jīng)方差分析在3d、7d較對(duì)照組和生理鹽水組顯著降低。說(shuō)明通過(guò)靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以顯著抑制ICAM-1的表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞間的粘附，改善缺血再灌注損傷的程度，達(dá)到保護(hù)腦組織，治療腦梗死的目的。

ICAM-1的表達(dá)是可以誘導(dǎo)的。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IL-1、TNF-α 可以誘導(dǎo) ICAM-1 的表達(dá)［14～16］。我們推測(cè)靜脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以改善腦缺血局部的微環(huán)境，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而抑制ICAM-1的表達(dá)。這值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示:靜脈注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療大鼠局限性腦梗死，可以改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，降低腦梗死體積，抑制ICAM-1的表達(dá)，從而保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，減輕缺血再灌注的損害。為更好的應(yīng)用于臨床還有以下問(wèn)題需進(jìn)一步研究:(1)經(jīng)靜脈注射的骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移入腦內(nèi)的方式途徑及其分子機(jī)制，如何提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)的數(shù)量。(2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植是否也存在治療時(shí)間窗。(3)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療局灶性腦缺血的生物安全性，有必要進(jìn)行廣泛、深入的基礎(chǔ)研究?？傊o脈移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療大鼠局限性腦梗死可能為臨床治療缺血性腦梗死開(kāi)辟了一條新的途徑。

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