于桂春， 孫莉娜， 周珊珊， 林靜涵， 張黎明

金雀異黃素是一種異黃酮類植物雌激素，其結(jié)構(gòu)和雌激素相似，在大豆等植物中含量豐富，同時作為一種酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑，廣泛應(yīng)用于各種研究。金雀異黃素不僅可以直接舒張血管，還可以抗動脈粥樣硬化、調(diào)整血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血管平滑肌增殖、抗氧化等，對多系統(tǒng)具有保護(hù)作用，在心腦血管疾病的防治中有重要地位［1～4］。如研究發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的嚴(yán)重并發(fā)癥——腦血管痙攣的主要發(fā)生機(jī)制之一即氧合血紅蛋白通過增強(qiáng)酪氨酸蛋白激酶活性引起血管持續(xù)收縮，金雀異黃素等PTK抑制劑可阻斷該效應(yīng)［5］。另有研究表明，金雀異黃素抑制血管平滑肌細(xì)胞 L型鈣通道鈣離子內(nèi)流，誘導(dǎo)血管舒張［6］。

cGMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，由血管平滑肌細(xì)胞可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)催化產(chǎn)生。在血管平滑肌細(xì)胞，cGMP一方面直接和間接抑制細(xì)胞膜電壓依賴鈣通道、促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣攝取、增加內(nèi)鈣外流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，另一方面降低收縮裝置對鈣離子的敏感性，導(dǎo)致血管平滑肌舒張［7］。目前尚無文獻(xiàn)報道不同細(xì)胞外鈣濃度下金雀異黃素對血管平滑肌舒縮狀態(tài)的影響。本研究通過觀察金雀異黃素在不同鈣條件下對大鼠血管平滑肌cGMP含量的影響，從金雀異黃素和鈣的角度為藥物研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

成年雄性SD大鼠8只，體重300±50g(購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗動物中心)，按不同干預(yù)方式隨機(jī)分為8組，每組4只。cGMP酶免疫分析試劑盒(貨號581021)，購自美國 Cayman Chemical公司。金雀異黃素、二甲基亞砜、毒胡蘿卜素內(nèi)酯、EGTA、硝苯地平、BAPTA-AM、NaCl、NaHCO3、葡萄糖、KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2均購自美國Sigma公司。水合氯醛、乙醚、三氯乙酸均為國產(chǎn)分析純。金雀異黃素用二甲基亞砜溶解配制，二甲基亞砜終濃度＜0.1%。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 腸系膜動脈的分離 成年雄性SD大鼠禁食水8h后稱重，10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉。開腹，動脈夾在近心端夾閉腸系膜動脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，靠近結(jié)扎部位剪斷血管，將腸系膜與腸管分離。將得到的組織浸于持續(xù)通入95%O2+5%CO2的4℃ Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液中，顯微鏡下分離腸系膜動脈血管。上述K-H液成分為(mmol/L):NaCl 130，NaHCO314.9，葡萄糖 5.5，KCl 4.7，KH2PO41.18，MgSO41.17，CaCl21.6，pH 7.2 ～7.4。

1.2.2 標(biāo)本處理 每只大鼠分離得到的腸系膜動脈在通氧K-H液中平衡20min后，分為實(shí)驗組(金雀異黃素100μmol/L)和對照組，分別給予下述干預(yù)條件37℃ 孵育20min:鈣離子濃度為0、0.6、1.2、和 1.8mmol/L，EGTA 2mmol/L，硝 苯 地 平10μmol/L，毒胡蘿卜素內(nèi)酯2μmol/L和BAPTA-AM 20μmol/L(n=4)。

1.2.3 cGMP測定 標(biāo)本孵育結(jié)束后立即放入液氮中冷凍。組織稱重后加入預(yù)冷的5%三氯乙酸4℃下勻漿化，4℃下1500r/min離心10min，取上清液，沉淀烘干稱重。水飽和乙醚洗滌3次，以除去三氯乙酸。采用cGMP酶免疫分析試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。組織cGMP含量以pmol/mg表示。

2 結(jié)果

2.1 不同鈣濃度下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

實(shí)驗組 cGMP含量在低鈣濃度組(0、0.6、1.2mmol/L)較正常鈣濃度組(1.8 mmol/L)降低(P＜0.01)，隨鈣濃度降低而逐漸下降;對照組cGMP含量在低鈣組與正常鈣濃度組無明顯差異，然而，隨著鈣濃度逐漸降低cGMP水平則逐漸升高(見圖1)。

圖1 不同鈣濃度下cGMP水平

2.2 鈣螯合劑作用下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

EGTA(2mmol/L)作用下，實(shí)驗組cGMP含量較EGTA對照組(5.13倍)和正常鈣條件實(shí)驗組(3.94倍)有顯著升高(P＜0.01)(見圖2)。BAPTA-AM(20μmol/L)作用下，實(shí)驗組cGMP含量與對照組無明顯差異，而較正常鈣條件實(shí)驗組降低(P＜0.01)(見圖3)。

圖2 不同鈣條件下cGMP水平

圖3 BAPTA-AM作用下cGMP水平

2.3 L型鈣通道阻斷劑和肌漿網(wǎng)鈣泵阻斷劑作用下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

硝苯地平(10μmol/L)作用下，實(shí)驗組較硝苯地平對照組和正常鈣條件實(shí)驗組cGMP含量明顯升高(P＜0.01)。毒胡蘿卜素內(nèi)酯(2μmol/L)作用下，實(shí)驗組較毒胡蘿卜素內(nèi)酯對照組cGMP升高(P＜0.01)，與正常鈣條件實(shí)驗組相比cGMP含量降低(P ＜0.01)(見圖2)。

3 討論

cGMP是血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，由細(xì)胞內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶催化產(chǎn)生。研究證明，cGMP通過抑制鈣內(nèi)流、增加內(nèi)鈣外流、促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣攝取等來降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，并降低鈣敏感性，從而使血管平滑肌細(xì)胞舒張［7，8］。因此，血管平滑肌的cGMP水平可以在一定程度上反映其收縮舒張狀態(tài)。本實(shí)驗中正常鈣條件對照組cGMP含量0.088 ±0.032pmol/mg，這與 Cleber等［9］測定的大鼠腸系膜動脈環(huán)基礎(chǔ)條件下0.09±0.01pmol/mg一致。正常鈣條件下，加入100μmol/L金雀異黃素可使 cGMP 含量抬高至 0.681 ±0.010pmol/mg，與對照組值相比，cGMP含量顯著升高(P＜0.01)。當(dāng)細(xì)胞外無鈣時，金雀異黃素可調(diào)節(jié)cGMP含量至0.146±0.040pmol/mg水平，低于對照組 0.256 ±0.054pmol/mg(P＜0.05)。這說明不同鈣濃度下金雀異黃素對血管平滑肌cGMP含量有不同的調(diào)節(jié)作用。

鈣離子作為底物協(xié)助促進(jìn)鳥苷酸環(huán)化酶的催化活性，但表現(xiàn)為sGC的負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。文獻(xiàn)報道［10］，將大鼠sGC轉(zhuǎn)染入不表達(dá)一氧化氮合酶、本身sGC活性很低的人胚腎HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)鈣離子抑制其sGC活性;Serfass等［11］也支持這一觀點(diǎn)。

本實(shí)驗中對照組cGMP含量在正常鈣濃度組和低鈣濃度組相比雖然無顯著差異，但可以看出，在正常細(xì)胞外鈣至零細(xì)胞外鈣水平之間，隨鈣濃度降低，cGMP含量逐漸升高。而金雀異黃素孵育20min后改變了此情況，實(shí)驗組cGMP含量低鈣濃度組較正常鈣濃度組降低(P＜0.01)，且隨鈣濃度降低逐漸下降。雖然實(shí)驗組低鈣濃度下cGMP含量低，但并不能因此推斷血管平滑肌舒張，因為低鈣濃度本身也會造成血管舒張。因此，我們將進(jìn)一步利用血管張力實(shí)驗深入研究。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮的關(guān)鍵［7，12］。胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高或鈣敏感性增加，平滑肌細(xì)胞收縮;相反則平滑肌細(xì)胞舒張。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流、肌漿網(wǎng)鈣釋放使胞漿鈣離子濃度升高，前者在血管平滑肌細(xì)胞主要通過細(xì)胞膜L型鈣通道流入，而Ca2+-ATP酶、Na+-Ca2+交換使鈣離子排出細(xì)胞外或重新進(jìn)入肌漿網(wǎng)內(nèi)，胞漿鈣離子濃度降低。

研究表明［6］，金雀異黃素對細(xì)胞膜L型鈣通道有抑制作用，在正常鈣條件下實(shí)驗組cGMP含量較對照組高(P＜0.01)，這可能與金雀異黃素抑制L型鈣通道有關(guān)，鈣離子內(nèi)流減少，鈣離子對sGC的抑制作用下降，從而使cGMP含量增加。實(shí)驗組和對照組加入L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(10μmol/L)后，對L型鈣通道的抑制作用更強(qiáng)，cGMP含量更高(P＜0.01)。而加入EGTA(2mmol/L)完全螯合細(xì)胞外鈣離子，使鈣內(nèi)流進(jìn)一步減少，實(shí)驗組cGMP含量達(dá)到最高。上述結(jié)果與鈣離子抑制sGC活性的觀點(diǎn)一致。但是為何在細(xì)胞外鈣為零時實(shí)驗組cGMP含量反而不高，還需要進(jìn)一步的探索。

毒胡蘿卜素內(nèi)酯能夠抑制肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，肌漿網(wǎng)鈣排空后不能回收，消除了內(nèi)鈣釋放的影響，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。對照組加入毒胡蘿卜素內(nèi)酯對結(jié)果無顯著影響，實(shí)驗組cGMP含量較正常該條件對照組下降。這與鈣離子抑制sGC的假說矛盾，但肌漿網(wǎng)排出鈣離子后胞漿內(nèi)鈣離子濃度短暫上升，可能對結(jié)果也有影響。BAPTA-AM可螯合所有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，無金雀異黃素存在時(即對照組)較正常鈣條件對照組cGMP含量升高，與鈣離子抑制sGC活性的觀點(diǎn)一致，實(shí)驗組與對照組無明顯差異，BAPTA-AM抹除了所有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣的影響，我們的結(jié)果提示金雀異黃素作用的最終通路在于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示在不同鈣濃度條件下金雀異黃素對大鼠腸系膜動脈平滑肌的cGMP影響不同，隨細(xì)胞外鈣濃度下降 cGMP含量降低，EGTA、硝苯地平存在下金雀異黃素使cGMP含量明顯增加，毒胡蘿卜素內(nèi)酯、BAPTA-AM存在下金雀異黃素使cGMP含量下降。不同鈣條件下金雀異黃素對血管平滑肌的舒縮影響及相應(yīng)機(jī)制還有待更深入的研究。

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