高宏艷， 徐寶林， 吳 江

腦出血(ICH)是嚴(yán)重危害人類健康的一類常見(jiàn)疾病。但迄今為止對(duì)于ICH仍缺乏很有效的治療方法。作為炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)——細(xì)胞因子，在ICH病理生理過(guò)程中扮演著重要角色。因此，有必要針對(duì)抑制ICH炎癥反應(yīng)這方面進(jìn)行研究，以指導(dǎo)ICH的臨床治療。亞低溫方法的腦保護(hù)作用近些年來(lái)逐漸被人們重視起來(lái)，作者擬通過(guò)研究亞低溫治療對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性ICH急性期腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響，以繼續(xù)探討頭部局部亞低溫治療的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康雄性Wistar大鼠36只，月齡3～4個(gè)月，體重250～300g。隨機(jī)分為常溫組、亞低溫組、假手術(shù)組，每組各12只。常溫組和亞低溫組用非肝素化自體血建立ICH模型，亞低溫組在建立模型后立即應(yīng)用頭部局部亞低溫連續(xù)治療48h，常溫組不予以治療，假手術(shù)組僅完成同樣的手術(shù)過(guò)程但不注血，亦不予以治療。

1.2 制備實(shí)驗(yàn)性ICH動(dòng)物模型 大鼠以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉生效后，俯臥于立體定位儀上，耳棒固定外耳孔，鼠門齒比前囟及外耳孔連線低2.4mm。無(wú)菌操作暴露顱骨，雙氧水顯示前囟，定位前囟后0.2mm，中線旁開(kāi)4mm，垂直進(jìn)針5.5mm，為大鼠尾殼核區(qū)。經(jīng)心臟穿刺取非肝素抗凝自體動(dòng)脈血50μl，5min內(nèi)緩慢注入大鼠尾殼核區(qū)，留針10min后，迅速拔針，無(wú)菌骨臘封閉顱骨后縫合皮膚。

1.3 亞低溫治療方法 ICH模型術(shù)后，將水循環(huán)顱腦制冷儀的冰墊緊貼敷于大鼠的注血側(cè)頭部，固定，亞低溫儀溫度設(shè)定在15℃ ～18℃，濕毛巾覆蓋于大鼠頭部及冰墊處，以維持大鼠頭部穩(wěn)定的低溫環(huán)境，將溫度傳感器放置于血腫中心部位，監(jiān)測(cè)治療側(cè)腦內(nèi)溫度，溫度控制在32℃ ～34℃。維持低溫治療48h。低溫過(guò)程中，注意大鼠的保暖，肛表監(jiān)測(cè)體溫，保持體溫在37℃ ～38℃之間。常溫組和假手術(shù)不給予治療，肛表監(jiān)測(cè)體溫，體溫在37℃ ～38℃之間。

1.4 腦組織病理標(biāo)本采集 各組分別取2只動(dòng)物，于制作模型48h后，以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉，生效后，立即取腦，沿進(jìn)針部位冠狀位切開(kāi)腦組織，進(jìn)行大體觀察。各組其余動(dòng)物于制作模型48h后，以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉，生效后，用0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌流固定，取腦，再用該液浸泡固定4～6h。沿針孔部位前1mm、后2mm冠狀位取材，修塊，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為2μm。分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 在顯微鏡下，每張切片均在血腫周圍以及注血側(cè)皮質(zhì)、胼胝體、脈絡(luò)叢的相同部位分別取5個(gè)相鄰的200倍視野，以整個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核染成棕黃色作為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)性ICH動(dòng)物的行為學(xué)變化 大鼠注血后活動(dòng)減少，反應(yīng)較術(shù)前遲鈍，部分動(dòng)物可見(jiàn)注血對(duì)側(cè)肢體活動(dòng)不靈活，有單方向轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象。

2.2 實(shí)驗(yàn)性ICH動(dòng)物的腦組織病理改變

2.2.1 大體觀察結(jié)果 常溫組:注血側(cè)腦組織腫脹，沿進(jìn)針部位冠狀位切開(kāi)腦組織，可見(jiàn)血腫呈類圓形，均勻一致，位于基底節(jié)區(qū)，直徑3mm左右，腦組織周圍水腫，有的可見(jiàn)中線移位。亞低溫組:注血側(cè)腦組織腫脹程度較常溫組輕。假手術(shù)組:可見(jiàn)腦表面的針孔，腦組織無(wú)腫脹。

2.2.2 HE染色結(jié)果 常溫組:血腫形成后48h，血腫周圍腦組織結(jié)構(gòu)不清，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腦組織水腫，神經(jīng)細(xì)胞核固縮、濃染，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死、消失。膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、增生，部分小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存積含鐵血黃素，聚集成片位于血管周圍。周圍小血管可見(jiàn)出血。亞低溫組:腦組織水腫明顯輕于常溫組，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)較輕，周圍小血管出血現(xiàn)象輕于常溫組。假手術(shù)組:針道附近有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯的組織水腫，無(wú)細(xì)胞的壞死及膠質(zhì)細(xì)胞增生(見(jiàn)圖1～圖3)。

2.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.3.1 TNF-α 常溫組:TNF-α 大量表達(dá)，與假手術(shù)組比較，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在血腫周圍、注血側(cè)皮質(zhì)、胼胝體、脈絡(luò)叢，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、胼胝體的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞。亞低溫組:TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞亦增多，但較常溫組明顯減少，P＜0.05，有顯著差異，與假手術(shù)組比較，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于血腫周圍的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，注血側(cè)皮質(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞、錐體細(xì)胞，室管膜細(xì)胞，脈絡(luò)叢細(xì)胞，胼胝體的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞。假手術(shù)組:在針道附近、注血側(cè)皮質(zhì)、胼胝體和脈絡(luò)叢可見(jiàn)個(gè)別陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞(見(jiàn)表1、圖4～圖6)。

2.2.3.2 NF-κB 常溫組:NF-κB 表達(dá)顯著增多，與假手術(shù)組比較，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性細(xì)胞主要位于血腫周圍、注血側(cè)皮質(zhì)、胼胝體和脈絡(luò)叢，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、胼胝體的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞為主，陽(yáng)性表達(dá)大部分在細(xì)胞核內(nèi)。亞低溫組:NF-κB在血腫周圍、注血側(cè)皮質(zhì)、胼胝體和脈絡(luò)叢也可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于亞低溫組，兩組間比較P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與假手術(shù)組比較，P＜0.01，有顯著差異。假手術(shù)組:可見(jiàn)散在NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞，個(gè)別陽(yáng)性表達(dá)位于核內(nèi)(見(jiàn)表2、圖7～圖9)。

表1 各組大鼠不同部位TNF-α的表達(dá)差異

表2 各組大鼠不同部位NF-κB的表達(dá)差異

3 討論

ICH是致死率、致殘率很高的一類疾病，且目前無(wú)論是脫水降顱壓、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)血壓等內(nèi)科治療方法，還是開(kāi)顱手術(shù)清除血腫、開(kāi)瓣減壓、腦室引流等外科方法都不能滿意地降低致死率和致殘率。因此ICH的治療是醫(yī)學(xué)界長(zhǎng)期關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

近些年，人們認(rèn)識(shí)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦具有免疫功能，能夠發(fā)生免疫反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)ICH也存在著炎癥反應(yīng)，作為炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)——細(xì)胞因子，在ICH的病理?yè)p傷中扮演著重要角色。

TNF-α是目前研究較多的前炎性細(xì)胞因子。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)它可來(lái)源于神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)、白細(xì)胞等［1］。TNF-α的過(guò)量表達(dá)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)主要發(fā)揮其毒性損害作用。大量臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，腦出血后血液、CSF以及血腫周圍TNF-α的表達(dá)均顯著增加，其表達(dá)程度與血腫大小成正相關(guān)，有繼續(xù)出血的患者TNF-α表達(dá)更高［2］。TNF-α對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用主要有以下幾個(gè)方面:(1)直接損傷作用:對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞具有毒性作用，導(dǎo)致其死亡。(2)參與血腦屏障破壞及腦水腫的形成。(3)參與引起細(xì)胞凋亡。(4)參與引起離子失調(diào)及神經(jīng)遞質(zhì)紊亂［3］。(5)參與引起凝血和抗凝機(jī)制平衡失調(diào)［4］。(6)促進(jìn)其他細(xì)胞因子及自由基等的釋放，協(xié)同加重?fù)p傷。近年來(lái)，諸多學(xué)者對(duì)TNF-α的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá)與NF-κB有著密切的關(guān)系。有人研究發(fā)現(xiàn)，ICH后1h就有炎癥反應(yīng)，出血2h后，在局部血管周圍就可以看見(jiàn)NF-κB復(fù)合體的活化，出血后8h表達(dá)更為廣泛，在出血同側(cè)血腫附近的皮質(zhì)內(nèi)亦可見(jiàn)NF-κB的表達(dá)增加，并且在數(shù)天內(nèi)持續(xù)增高，參與造成腦損傷［5］。因此，抑制細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)，從而減輕大量細(xì)胞因子釋放參與造成的血腦屏障破壞、腦水腫、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡等一系列病理變化，是ICH治療方面有待開(kāi)拓的一個(gè)領(lǐng)域［6］。

近來(lái)研究表明亞低溫療法可以提高ICH患者的生存率和生存質(zhì)量。但是，對(duì)于亞低溫腦保護(hù)機(jī)制方面的研究仍很少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究頭部局部亞低溫方法對(duì)實(shí)驗(yàn)性ICH大鼠腦組織內(nèi)TNF-α及調(diào)控其表達(dá)的NF-κB的影響，從而進(jìn)一步深入探討亞低溫的腦保護(hù)作用機(jī)制。

采用大鼠腦內(nèi)緩慢注入非肝素化自體血的方法，建立實(shí)驗(yàn)性ICH動(dòng)物模型。各組分別于制作模型后48h后取腦連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色及用抗TNF-α和抗NF-κB的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色(SP法)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在大鼠ICH后48h血腫周圍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞增生，并且腦組織內(nèi)前炎性細(xì)胞因子TNF-α以及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和翻譯的NF-κB明顯增多。這表明了在ICH急性期腦組織內(nèi)炎癥反應(yīng)的存在。亞低溫治療可以下調(diào)NF-κB和TNF-α的表達(dá)，并且在亞低溫治療組腦血腫周圍炎細(xì)胞減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生程度減輕，以及直接病理觀察發(fā)現(xiàn)腦組織的腦水腫程度輕于常溫組，以上結(jié)果均支持亞低溫方法可以抑制炎癥反應(yīng)，起到腦保護(hù)的作用。而且可以推論，亞低溫方法由于抑制了炎癥反應(yīng)調(diào)控因子NF-κB的表達(dá)，從而抑制了炎癥反應(yīng)。

圖1 常溫組血腫周圍腦組織結(jié)構(gòu)不清，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫，神經(jīng)細(xì)核固縮，核濃染，周圍小血管出血(HE，100×)

圖2 亞低溫組血腫周圍有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腦組織水腫明顯輕于常溫組，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)較輕(HE，100×)

圖3 假手術(shù)組針道附近無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)組織水腫(HE，200×)

圖4 常溫組TNF-α在血腫周圍的表達(dá)(免疫組化，200×)

圖5 亞低溫組TNF-α在血腫周圍的表達(dá)(免疫組化，200×)

圖6 假手術(shù)組TNF-α在血腫周圍的表達(dá)(免疫組化，200×)

圖7 常溫組NF-κB在皮質(zhì)的表達(dá)(免疫組化，200×)

圖8 亞低溫組NF-κB在皮質(zhì)的表達(dá)(免疫組化，200×)

圖9 假手術(shù)組NF-κB在皮質(zhì)的表達(dá)(免疫組化，200×)

［1］ Mayne M，Ni W，Yan HJ，et al.Antisense oligodeoxynucleotide inhibition of tumor necrosis factor-alpha expression is neuroprotective after intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2001，32:240 － 248.

［2］ Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2005，36(1):86 －91.

［3］ Huang R，Sochocka E，Hertz L.Cell culture studies of the role of elevated extracellular glutamate and K+in neuronal cell death during and after anoxia/ischemia［J］.Neurosci Biobehav Rev，1997，21:129－134.

［4］ Szaflarski J，Burtrum D，Silverstein FS.Cerebral hypoxia ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats［J］.Stroke，1995，26:1093 －1100.

［5］ Susan L，Hickenbottom，MD，James C，et al.Nuclear factor-κ B and cell death after experimental intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1999，30:2472 －2478.

［6］ Tarkowski E.Intracerebral production of tumor necrosis factor-alpha，a local neuroprotective agent，in Alzheimer disease and vascular dementia［J］.JClin Immunol，1999，19(4):223 －230.