穆懷彬，伏兵哲，德 英

（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；2．寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021）

苜蓿（Medicago sativa）富含蛋白質(zhì)，有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性和穩(wěn)定的生產(chǎn)力，適口性好，是世界上栽培面積最廣、最主要的優(yōu)良豆科牧草之一，被人們譽(yù)為“牧草之王”。據(jù)文獻(xiàn)資料［1］記載，苜蓿的起源中心是伊朗，之后逐漸傳入其他國(guó)家，在中國(guó)已有2 000多年的栽培歷史。目前，全世界種植苜蓿已達(dá)3 330萬(wàn)hm2。我國(guó)中西部和北方地區(qū)的中溫帶和半干旱區(qū)為苜蓿最佳生長(zhǎng)區(qū)，苜蓿種植遍及我國(guó)北方14個(gè)省區(qū)，種植面積達(dá)280萬(wàn)hm2，對(duì)我國(guó)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展起到了重要作用［2］。同時(shí)，苜蓿具有抗干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)沙、喜光照等特點(diǎn)，又是改良土壤、防止水土流失、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的草種之一。

國(guó)內(nèi)外已在苜蓿引種栽培、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、病蟲(chóng)害防治、遺傳育種以及抗逆性等方面都做了不少的研究。其中，苜蓿的生態(tài)適應(yīng)性研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，有關(guān)苜蓿生態(tài)適應(yīng)性的研究和報(bào)道很多，研究領(lǐng)域逐漸從形態(tài)水平過(guò)渡到生理生化以及分子生物學(xué)水平［3－7］。

苜蓿生育期需水較多，通常比禾本科多2倍，每形成1g干物質(zhì)需水700～800g，田間需水量達(dá)5 855m3／hm2［8］。而我國(guó)北方苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，因此，苜蓿的抗旱性研究顯得尤為重要。幼苗期是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)非常重要的時(shí)期，幼苗期抗旱性能的強(qiáng)弱直接影響到植物能否順利完成整個(gè)生育期，故在實(shí)際生產(chǎn)中常說(shuō)“保苗是關(guān)鍵”。本研究選擇10個(gè)苜蓿品種，用PEG－6000溶液人工模擬干旱處理，在其幼苗期分析其葉片細(xì)胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、類(lèi)胡蘿卜素（Car）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性研究其抗旱性，并探尋苜蓿幼苗期抗旱的生理生化規(guī)律，以期為苜蓿的選種栽培、優(yōu)化育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 供試苜蓿品種及其來(lái)源見(jiàn)表1。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在20℃室溫下（經(jīng)實(shí)測(cè)，試驗(yàn)期內(nèi)水培室溫度為17～24℃），采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方水培10個(gè)品種苜蓿幼苗90～100株。水培裝置包括：營(yíng)養(yǎng)液盆、水培筐、沙網(wǎng)、碎石、細(xì)砂。播種前以上設(shè)備和材料均在90℃高溫下滅菌5h，苜蓿種子經(jīng)HgCl2消毒。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至三到四葉期時(shí)進(jìn)行干旱脅迫。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)水勢(shì)：0（CK）、－0．3、－0．6、－0．9和－1．2MPa。處理后每2d進(jìn)行稱(chēng)量補(bǔ)水以維持溶液濃度。處理后第7天取樣，取樣時(shí)間為08：00－10：00。除細(xì)胞膜透性即時(shí)測(cè)定外，其余樣品均迅速冷凍在－20℃的低溫冰箱中，以備測(cè)定其余指標(biāo)。

表1 供試苜蓿品種及其來(lái)源

不同水勢(shì)所需PEG－6000溶液的量計(jì)算公式［9］如下：

式中，ΨS為溶液的水勢(shì)（MPa）；C 為PEG－6000溶液的濃度（g／kg）；T 為溫度（℃）。

1．3 測(cè)定方法 指標(biāo)測(cè)定參照李合生［10］、張志良和翟偉箐［11］、高俊風(fēng)［12］的方法。采用電導(dǎo)率儀法測(cè)定細(xì)胞膜透性；采用TBA－MDA顯色法測(cè)定MDA含量；采用酸性茚三酮法測(cè)定Pro含量；采用95%乙醇提取法測(cè)定Car含量；采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定SOD活性。

1．4 數(shù)據(jù)分析 采用DPS v8．01和Excel 2003軟件數(shù)據(jù)處理與分析。

目前，模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法被廣泛應(yīng)用在品種抗逆性評(píng)價(jià)。隸函數(shù)法避免了利用單一指標(biāo)進(jìn)行抗逆性評(píng)價(jià)所帶來(lái)的片面性，它能綜合所有指標(biāo)，并在權(quán)重統(tǒng)一的情況下，對(duì)不同種或品種進(jìn)行抗逆性排序，使評(píng)定結(jié)果更客觀全面地接近實(shí)際情況。隸屬函數(shù)的分析方法如下：

式中，Yij為i品種的j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij為i品種的j指標(biāo)的均值；Xj，max為各品種j指標(biāo)均值的最大值；Xj，min為各品種j指標(biāo)均值的最小值。若j指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)，則用公式（2）；若j指標(biāo)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)，則用公式（3）。

2 結(jié)果

2．1 干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片細(xì)胞膜透性的影響 隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片的細(xì)胞膜透性總體呈上升趨勢(shì)。水勢(shì)從0到－1．2MPa，葉 片 細(xì) 胞 膜 透 性 均 值 為 17．11%、18．50%、28．53%、42．75%和44．82%。隨著水勢(shì)的降低，細(xì)胞膜透性的變化呈現(xiàn)出明顯的兩個(gè)拐點(diǎn)，即－0．3和－0．9MPa水勢(shì)。當(dāng)水勢(shì)高于－0．3MPa時(shí)，與對(duì)照相比細(xì)胞膜透性變化不大；當(dāng)水勢(shì)低于－0．3 MPa時(shí)，細(xì)胞膜透性開(kāi)始大幅增加，表明苜蓿幼苗開(kāi)始受到較為嚴(yán)重的干旱脅迫；當(dāng)水勢(shì)降到－0．9 MPa時(shí)，細(xì)胞膜透性較對(duì)照增加了149．85%；當(dāng)水勢(shì)低于－0．9MPa時(shí)，細(xì)胞膜透性的增幅開(kāi)始下降，－1．2MPa水勢(shì)的細(xì)胞膜透性只比－0．9MPa的增加了4．84%（圖1）。結(jié)果表明，當(dāng)水勢(shì)在－0．9 MPa左右時(shí)，苜蓿幼苗葉片的細(xì)胞膜可能已被完全或接近完全破壞。苜蓿幼苗抗旱葉片細(xì)胞膜透性變化的臨界值可能在－0．9MPa水勢(shì)附近。

圖1 干旱脅迫第7天時(shí)苜蓿幼苗葉片細(xì)胞膜透性的變化

2．2 干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片中丙二醛含量的影響 水勢(shì)從0到－1．2MPa，葉片中MDA含量的均值分別為0．011 0、0．011 9、0．017 6、0．015 8和0．014 8μmol／g（表2）?？傮w看來(lái)，隨著水勢(shì)的降低，MDA含量呈上升趨勢(shì)，且10個(gè)品種間MDA含量差異顯著（P＜0．05）。當(dāng)水勢(shì)為－0．3MPa時(shí)，MDA含量與對(duì)照相比變化不大；當(dāng)水勢(shì)降到－0．6MPa時(shí)，MDA含量達(dá)到最大值；當(dāng)水勢(shì)低于－0．6MPa時(shí)，MDA含量不升反降但仍高于對(duì)照。結(jié)果表明，當(dāng)水勢(shì)達(dá)到－0．6MPa時(shí)，苜蓿幼苗葉片中的膜脂過(guò)氧化作用已接近峰值。苜蓿幼苗抗旱的臨界水勢(shì)可能介于－0．9～－0．6MPa。

2．3 干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片中脯氨酸含量的影響 隨著水勢(shì)的降低，苜蓿幼苗葉片中Pro含量總體呈先降后升的變化趨勢(shì)，且10個(gè)品種間Pro含量差異顯著（P＜0．05）。水勢(shì)從0到－1．2 MPa，葉片中Pro含量的均值分別為104．17、75．28、184．89、289．54和248．23μg／g（圖2）。當(dāng)水勢(shì)為－0．3MPa時(shí)，Pro含量較對(duì)照下降27．73%；當(dāng)水勢(shì)低于－0．3MPa時(shí)，Pro含量開(kāi)始上升；當(dāng)水勢(shì)下降到－0．9MPa時(shí)，Pro含量較對(duì)照上升177．95%；當(dāng)水勢(shì)低于－0．9MPa時(shí)，Pro含量又略呈下降趨勢(shì)?？赡墚?dāng)水勢(shì)達(dá)到－0．9MPa時(shí)，苜蓿幼苗葉片細(xì)胞中的Pro滲調(diào)機(jī)能已達(dá)極限。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢(shì)左右。

表2 干旱脅迫第7天時(shí)苜蓿幼苗葉片中丙二醛含量的變化 μmol／g

圖2 干旱脅迫第7天時(shí)苜蓿幼苗葉片中脯氨酸含量的變化

2．4 干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響 在干旱脅迫下，苜蓿幼苗葉片中Car含量呈上升趨勢(shì)，且10個(gè)品種間Car含量差異顯著（P＜0．05）。水勢(shì)從0到－1．2MPa，葉片中Car含量的均值分別為0．071 0、0．103 5、0．111 0、0．138 0和0．119 6μmol／g（表3）。當(dāng)水勢(shì)下降到－0．9MPa時(shí)，Car含量達(dá)到最大值，較對(duì)照增加94．37%；當(dāng)水勢(shì)繼續(xù)下降時(shí)，Car含量呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，當(dāng)水勢(shì)降到－0．9MPa時(shí)，苜蓿幼苗葉片細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)的抵御能力可能已達(dá)極限。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢(shì)左右。

表3 干旱脅迫第7天時(shí)苜蓿幼苗葉片類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 μmol／g

2．5 干旱脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉片中超氧化物歧化酶活性的影響 隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片中SOD活性總體呈先降后升再降的變化趨勢(shì)。水勢(shì)從0到－1．2MPa，葉片中SOD活性的均值分別為143．36、96．87、77．07、244．59和98．53 U／g（圖3）。當(dāng)水勢(shì)為－0．3和－0．6MPa時(shí)，SOD活性均低于對(duì)照；當(dāng)水勢(shì)下降至－0．9MPa時(shí)，SOD活性大幅升高，較對(duì)照增加了70．61%；而當(dāng)水勢(shì)進(jìn)一步下降，SOD活性又大幅下降，－1．2MPa水勢(shì)時(shí)的SOD活性較對(duì)照下降了31．27%。可能當(dāng)水勢(shì)降至－0．9MPa時(shí)，苜蓿幼苗葉片細(xì)胞中SOD活性被完全激活；而當(dāng)水勢(shì)進(jìn)一步降低，細(xì)胞可能已難以抵御干旱脅迫，導(dǎo)致SOD活性下降。苜蓿幼苗抗旱的臨界值可能在－0．9MPa水勢(shì)左右。

圖3 干旱脅迫第7天時(shí)苜蓿幼苗葉片內(nèi)超氧化物歧化酶活性的變化

2．6 苜蓿品種抗旱性綜合評(píng)價(jià)

上述抗性指標(biāo)的分析只能表明10個(gè)苜蓿品種在干旱脅迫下總的生理響應(yīng)過(guò)程，而難以判斷出具體品種的抗旱性強(qiáng)弱，這就需要借助數(shù)學(xué)方法來(lái)分析。根據(jù)隸屬函數(shù)的分析方法，利用本試驗(yàn)所測(cè)的5個(gè)抗旱指標(biāo)在不同水勢(shì)下的均值，計(jì)算出10個(gè)苜蓿品種不同指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，并再求其平均值，最后根據(jù)隸屬函數(shù)的平均值進(jìn)行排序，得出10個(gè)苜蓿品種的抗旱性強(qiáng)弱（表4）；依次為德國(guó)德貝＞大富豪＞阿爾岡金＞W(wǎng)est blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞愛(ài)菲尼特＞新疆大葉＞四季旺。

3 討論

植物的抗旱機(jī)制涉及到一個(gè)復(fù)雜的體系，單一的指標(biāo)很難說(shuō)明某種植物（品種）的抗旱性的強(qiáng)弱，必須測(cè)定多種指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上作出綜合評(píng)判。本研究所選的指標(biāo)均是目前較常用且與抗旱性密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)，盡管隨著研究進(jìn)一步的深入，人們對(duì)于某些指標(biāo)與抗旱性的關(guān)系產(chǎn)生了疑問(wèn)。但可以肯定的是，這些指標(biāo)與抗旱性是相關(guān)的，只是它們之間的關(guān)系可能并不是以前人們所認(rèn)識(shí)的那樣呈簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表4 各抗旱指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及10個(gè)苜蓿品種綜合抗旱性排序

本研究表明，在－0．9MPa水勢(shì)時(shí)，各測(cè)試指標(biāo)的變化趨勢(shì)均出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，說(shuō)明－0．9 MPa可能是苜蓿幼苗耐旱的關(guān)鍵水勢(shì)點(diǎn)，同時(shí)苜蓿幼苗耐旱的極限可能是在一個(gè)范圍內(nèi)。根據(jù)本研究結(jié)果可以推斷出苜蓿幼苗抗旱的臨界值在－0．9 MPa水勢(shì)左右。此外，值得注意的是，細(xì)胞膜透性及丙二醛含量在－0．3MPa水勢(shì)時(shí)與對(duì)照相比變化不大，而脯氨酸含量與超氧化物歧化酶活性均在－0．3MPa水勢(shì)時(shí)下降。這些變化表明苜蓿幼苗在－0．3MPa水勢(shì)下幾乎沒(méi)有受到干旱脅迫的傷害。這可能是由于苜蓿本身具有較強(qiáng)的抗旱性，或者是由其他生理原因造成［13］。

目前對(duì)于游離脯氨酸是否適宜作為抗旱性指標(biāo)的爭(zhēng)議是最多的。最大的疑問(wèn)在于，干旱脅迫下，游離脯氨酸的累積途徑有很多，既可能有適應(yīng)性的意義，又可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)［14］。由此可見(jiàn)，脯氨酸的積累與植物的抗旱性之間可能并不是簡(jiǎn)單的正相關(guān)關(guān)系。但脯氨酸在干旱脅迫下大量積累，證明了其對(duì)干旱的敏感性，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，因此還是可以把它作為評(píng)判品種抗旱性強(qiáng)弱的指標(biāo)或者參數(shù)。但是，在本研究中也出現(xiàn)了隨著脅迫的加劇，某些苜蓿品種的脯氨酸含量呈下降趨勢(shì)的現(xiàn)象，這可能是苜蓿幼苗對(duì)于干旱脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，其葉片可能產(chǎn)生了暫時(shí)的生理休克［15］。

多項(xiàng)研究表明［16－18］，植物在遭受逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶活性均會(huì)上升，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。一般認(rèn)為，抗性較強(qiáng)的品種其葉片中類(lèi)胡蘿卜素的含量較高，并且具有較高的超氧化物歧化酶活性。但在本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，類(lèi)胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶活性出現(xiàn)下降，這可能是由于抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的抵抗修復(fù)能力是有一定閾值的［19］，當(dāng)脅迫超過(guò)一定程度后，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)也將失去保護(hù)作用。此外，抗氧化系統(tǒng)保護(hù)能力的強(qiáng)弱并不在于單個(gè)物質(zhì)的活性大小或含量多少上，關(guān)鍵在于它們之間的協(xié)同性是否好［20］，因?yàn)榍宄钚匝跏欠植襟E的，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)中的每種物質(zhì)只在特定的步驟上起作用。

綜上所述，隨著干旱脅迫的加劇，苜蓿幼苗葉片中細(xì)胞膜透性、丙二醛含量和類(lèi)胡蘿卜素含量總體呈上升趨勢(shì)；脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性總體呈先降后升的趨勢(shì)；苜蓿幼苗期的耐旱極限范圍可能在－0．9MPa水勢(shì)附近；利用隸屬函數(shù)分析得出10個(gè)苜蓿品種的抗旱性強(qiáng)弱為：德國(guó)德貝＞大富豪＞阿爾岡金＞W(wǎng)est blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞愛(ài)菲尼特＞新疆大葉＞四季旺。

［1］ 耿華珠．中國(guó)苜蓿［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995：25－45．

［2］ 張曉霞，高永革，嚴(yán)學(xué)兵，等．紫花苜?？篃嵝澡b定與評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展［J］．草業(yè)科學(xué)，2010，27（2）：113－118．

［3］ Zeid I M，Shedeed Z A．Response of alfalfa to putrescine treatment under drought stress［J］．Biologia Plantarum，2006，50（4）：635－640．

［4］ Goicoechea N，Trivedi S，Halshaw L，et al．Influence of carbuncular mycorrhizae and Rhizobium on nutrient content and water relations in drought stressed alfalfa［J］．Plant and Soil，1997，192：261－268．

［5］ Lindsay W B，Aleida H W，Megan H R，et al．Water relations and adaptations to increasing water deficit in three perennial legumes，Medicago sativa，Dorycnium hirsutumand Dorycnium rectum［J］．Plant Soil，2007，290：231－243．

［6］ 姜義寶，李建華，方麗云，等．鈣處理對(duì)苜蓿幼苗抗旱性的影響［J］．中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2008，30（1）：117－120．

［7］ 徐向南，易津，于林清，等．紫花苜?？购敌匝芯窟M(jìn)展［J］．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（21）：180－184．

［8］ 曹致中．優(yōu)質(zhì)苜蓿栽培與利用［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002．

［9］ Michel B E，Kaufmann M R．The osmotic potential of polyethylene glycol 6000［J］．Plant Physiology，1973，51：914－916．

［10］ 李合生．植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)［M］．北京：高等教育出版社，2000．

［11］ 張志良，翟偉箐．植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京：高等教育出版社，2003．

［12］ 高俊風(fēng)．植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京：高等教育出版社，2006．

［13］ 孟林，毛培春，張國(guó)芳，等．17個(gè)苜蓿品種苗期抗旱性鑒定［J］．草業(yè)科學(xué)，2008，25（1）：21－25．

［14］ 劉娥娥，宗會(huì)，郭振飛，等．干旱、鹽和低溫脅迫對(duì)水稻幼苗脯氨酸含量的影響［J］．熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2000，8（3）：235－238．

［15］ 錢(qián)永常，余叔文．大豆對(duì)SO2的適應(yīng)性反應(yīng)［J］．植物生理學(xué)報(bào)，1991，17（3）：232－238．

［16］ 鄒琦，李德全，鄭國(guó)生，等．作物抗旱生理生態(tài)研究［M］．濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1994．

［17］ 霍學(xué)敏，呼天明，楊培志，等．干旱脅迫對(duì)苗期紫花苜蓿3種生理指標(biāo)的影響［J］．草業(yè)科學(xué)，2010，27（4）：89－92．

［18］ 張永鋒，梁正偉，隋麗，等．鹽堿脅迫對(duì)苗期紫花苜蓿生理 特 性 的 影 響 ［J］．草 業(yè) 學(xué) 報(bào)，2009，18（4）：230－235．

［19］ 王久生，王根軒．CO2倍增對(duì)滲透脅迫下小麥葉片抗氧化酶類(lèi)及細(xì)胞程序性死亡的影響［J］．植物生理學(xué)報(bào)，2000，26（5）：453－457．

［20］ 韓瑞宏．苗期紫花苜蓿（Medicago sativa）對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)機(jī)制研究［D］．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2006．