程桂茹, 王淑娟, 鄒 巖, 張 龍

(長春工業(yè)大學化學工程學院,吉林長春 130012)

0 引 言

達卡巴嗪(DTIC),化學名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸櫞酸鹽,是一種新型抗腫瘤藥物,臨床用于惡性黑色素瘤的治療,對肺鱗癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等亦有一些治療作用[1-3],但由于達卡巴嗪遇光或熱易變化,在水中不穩(wěn)定,限制了它的使用。如將DT IC包封在脂質(zhì)體中,不僅擴大了DTIC的使用范圍,而且提高了療效。脂質(zhì)體作為藥物載體,可以減小藥物劑量,降低藥物的毒性,減小副作用,具有靶向性[4-5]。文中采用Box-Behnken中心組合設計[6],響應面分析法優(yōu)化DTIC脂質(zhì)體制備工藝條件,為更好地應用DTIC提供了理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

DTIC,長春一心藥業(yè)公司;

大豆卵磷脂,天津市光復精細化工研究所;

膽固醇,天津市光復精細化工研究所;

三氯甲烷,天津天泰精細化學品有限公司;

磷酸氫二鈉,天津市福晨化學試劑廠;

磷酸二氫鈉,北京化工廠。

1.2 儀器

UV754N型紫外分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;

AL104型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;

203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海豫康科教儀器設備有限公司;

KQ3200型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;

JXA840型透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;

THZ-82型汽浴恒溫振蕩器,江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠。

2 方 法

2.1 DTIC含量的測定

2.1.1 紫外最大吸收波長測定

配制0.5 mg/mL的DTIC磷酸鹽緩沖液(pH值 7.4,簡稱 PBS)的標準液,并稀釋至0.02 mg/mL,在紫外光區(qū)(UV)與可見光區(qū)(VIS)作全波長掃描190～500 nm,確定最大吸收的波長為320 nm。

2.1.2 標準曲線

精密稱取 25 mg DTIC用PBS溶解,并用50 mL容量瓶定容,配成0.5 mg/mL的標準液。用取液器分別量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mL于50 mL容量瓶中,再用磷酸鹽緩沖液定容,其濃度分別為0.0005,0.004,0.008,0.012,0.016,0.020 mg/mL。以磷酸鹽緩沖液為空白,在最大吸收波長下測定吸收值,將藥物濃度與吸光度進行直線回歸,得回歸方程:

2.2 脂質(zhì)體的制備

采用逆相蒸發(fā)法:將適量的磷脂與0.125 g膽固醇溶解在適量的氯仿中,再將0.01 g DTIC溶解在適量 PBS中,將上述溶液于旋干瓶中混合,水浴超聲,減壓蒸發(fā)除去有機溶劑,達到膠態(tài)后,滴加5 mL磷酸鹽緩沖液,旋轉(zhuǎn)幫助器壁上的凝膠水化脫落,然后在減壓下繼續(xù)蒸發(fā),制得水性混懸液,通過透析除去未包封的藥物,即得到7 mL大單層脂質(zhì)體。

2.3 脂質(zhì)體包封率的測定

分別取1 mL DTIC脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體裝入透析袋內(nèi),置于盛有40 mL PBS的燒杯內(nèi),磁力攪拌,透析2 h。取透析液按藥物含量測定中所述的采用紫外分光光度法測定,計算出游離藥物的含量[7-8]。

2.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上,選擇對包封率影響較為顯著的3個因素作為考察對象,即大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比(X1),水浴超聲時間(X2),PBS體積(X3),根據(jù)單因素試驗結(jié)果以及在最高或最低水平時制備DTIC脂質(zhì)體的可行性,綜合選擇各因素的水平。

因素及水平的設計見表1。

表1 實驗因素水平表

2.5 形態(tài)學研究

取少量DTIC脂質(zhì)體制劑加蒸餾水稀釋,超聲波分散,再滴至專用銅網(wǎng)上,自然揮發(fā),使粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積,用透射電子顯微鏡觀察并照相。

2.6 脂質(zhì)體的釋藥性曲線

取1 mL DTIC脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體裝入透析袋內(nèi),置于50 mL磷酸鹽緩沖液中透析,同時取1 mL DTIC脂質(zhì)體溶液(16 mg/mL)于透析袋中,在50 mL磷酸鹽緩沖液中同時透析以做對比,透析溫度(37±0.5) ℃,于氣浴振蕩器中進行,定時取樣10 mL,同時補加10 mL磷酸鹽緩沖液,采用紫外分光光度計測定不同時間透析液中藥物的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 響應面分析

根據(jù) Box-Behnken中心組合設計原理,以X1,X2,X3這3個因素為自變量,以脂質(zhì)體的包封率為響應值,做3因素3水平的響應面分析設計實驗,所需實驗次數(shù)為12次。為了考察實驗誤差的大小,將中心點的實驗重復進行了3次,實驗設計與結(jié)果見表2。

利用Minitab軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到DTIC脂質(zhì)體的包封率對大豆卵磷脂與膽固醇用量比、超聲時間、PBS用量的二次多項回歸模型為:

表2 DTIC脂質(zhì)體的試驗設計與試驗結(jié)果

對該模型進行顯著性檢驗,回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 DTIC脂質(zhì)體包封率的回歸模型方差分析

由表3可知,P=0.001＜0.01,表明回歸模型顯著;F=0.97＞0.05,P=0.545＞0.05,不顯著;復相關系數(shù)R為0.99795,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小,可以用此模型來分析和預測DTIC脂質(zhì)體的制備工藝結(jié)果。

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表4 DTIC脂質(zhì)體包封率回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知,模型的一次項X1極顯著,X2,X3不顯著;二次項X21,X22,X23極顯著;交互項 X1X2顯著,其它交互項不顯著;表明各影響因素對于DTIC脂質(zhì)體的包封率的影響不是簡單的線性關系。

表5 回歸分析

表5中的R-Sq的預測和調(diào)整數(shù)值相差不大,而且接近1。S數(shù)值不大,滿足擬合要求。所以,該模型可用于三磷酸胞苷二鈉脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化的理論預測。

3.1.1 響應面優(yōu)化

超聲時間、磷酸鹽緩沖液的用量及其交互作用對達卡巴嗪脂質(zhì)體包封率影響的曲面和等值線如圖1所示。

由圖1可知,在PBS用量為7.0～8.0 mL,超聲時間在4～5 min的范圍內(nèi),包封率不斷增加,之后隨著磷酸鹽緩沖液的用量和超聲時間的延長,包封率有下降的趨勢。

圖1 Y=f(X2,X3)的響應曲面及其等值線

超聲時間、大豆卵磷脂與膽固醇用量比及其交互作用對達卡巴嗪脂質(zhì)體包封率影響的曲面和等值線如圖2所示。

由圖2可知,大豆卵磷脂與膽固醇用量比對包封率的影響顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,當大豆卵磷脂與膽固醇用量比處于5.2左右時,包封率出現(xiàn)極值。

圖2 Y=f(X1,X2)的響應曲面及其等值線

磷酸鹽緩沖液的用量、大豆卵磷脂與膽固醇用量比及其交互作用對達卡巴嗪脂質(zhì)體包封率影響的曲面和等值線如圖3所示。

圖3 Y=f(X1,X3)的響應曲面及其等值線

由圖3可知,在PBS用量為7.0～8.0 mL和大豆卵磷脂與膽固醇用量比為4～5的范圍內(nèi),包封率不斷增加,之后隨著PBS用量和大豆卵磷脂與膽固醇用量的增大,包封率有下降的趨勢。

等值線圖的形狀可反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。由圖1～圖3等值線圖可以看出,超聲時間和大豆卵磷脂與膽固醇用量比之間的交互作用顯著,表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。相比較而言,PBS用量和超聲時間之間,以及大豆卵磷脂與膽固醇用量比和PBS用量之間的交互作用較小。

比較圖1～圖3可知,大豆卵磷脂與膽固醇用量比對包封率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,最佳值在5.2附近;而超聲時間和PBS用量對包封率影響次之,表現(xiàn)為曲線較平滑,且隨著數(shù)值增加或減少,響應值變化較小。

為進一步確定最高點,對回歸模型取一階偏導數(shù)等于零,得到:

解方程得到:

變換為真實值可得大豆卵磷脂與膽固醇用量比為 5.01,PBS用量為8.04 mL,超聲時間為5.2 min。在此條件下,預測DTIC脂質(zhì)體的包封率為94.18%。

3.1.2 驗證實驗

在此條件下平行制備脂質(zhì)體5次,實際測得的平均包封率為94.20%,與理論預測值相比,其相對誤差為0.02%。因此,基于響應曲面法所得的優(yōu)化制備工藝參數(shù)準確可靠。

3.2 脂質(zhì)體的釋藥性曲線

實驗數(shù)據(jù)如圖4所示。

由圖4可知,DTIC的脂質(zhì)體突釋是由未包封的 DTIC從透析膜透過的結(jié)果,脂質(zhì)體在40 min以后平穩(wěn)釋放藥物。

圖4 達卡巴嗪脂質(zhì)體的藥物釋放曲線

3.3 DTIC脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑觀察

經(jīng)逆相蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體為乳白色懸液,電鏡下觀察照片為圓形或類圓形小體,脂質(zhì)體或分散存在或聚集在一起。達卡巴嗪脂質(zhì)體是粒徑均勻的球形或近球狀的小囊泡。粒徑測定結(jié)果表明,平均粒徑在50 nm左右。電鏡照片如圖5所示。

圖5 DTIC脂質(zhì)體的透射電鏡照片(放大倍數(shù) ×10 K)

4 結(jié) 語

基于實驗設計,通過二次回歸設計得到了DT IC脂質(zhì)體的包封率與大豆卵磷脂及膽固醇用量比、PBS用量和超聲時間關系的回歸模型,經(jīng)檢驗證明,該模型是合理可靠的,能夠較好地預測DT IC脂質(zhì)體的包封率。

利用模型的響應面及其等值線,對影響DT IC脂質(zhì)體的包封率的關鍵因素及其相互作用進行探討,得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為:大豆卵磷脂與膽固醇用量比為5.01,PBS用量為8.02 mL,超聲時間為 5 min。脂質(zhì)體的包封率為94.18%。實測值為94.20%,僅差0.02%,因此,利用響應面分析的方法對脂質(zhì)體的制備工藝進行優(yōu)化,可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù),預測工藝條件與實際工藝條件之間具有較好的擬合度,Box-Behnken中心組合設計可以應用于DT IC脂質(zhì)體工藝條件的篩選。

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