劉澤林，陳 燕

（1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌330003；2.武警江西總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)科，南昌330001）

近年的研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞具有誘發(fā)血管新生的潛能，并且能用于改善缺血性臟器的血流和功能［1］?；谶@一特性，國(guó)內(nèi)外已廣泛開(kāi)展了利用病人自體的骨髓干細(xì)胞來(lái)治療冠心病及其他缺血性心血管疾病的臨床試驗(yàn)［2］。盡管很多臨床試驗(yàn)報(bào)告了這一新治療技術(shù)是安全的，但有些患者的治療效果并不理想［3］。其原因可能與患者自體的骨髓干細(xì)胞的質(zhì)量及缺血性臟器的局部狀況有關(guān)。有研究資料顯示，糖尿病等可能導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞受損，并影響其誘發(fā)血管新生的潛能［4－5］。本研究的目的旨在調(diào)查糖尿病對(duì)骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生血管生長(zhǎng)因子（VEGF）的能力以及骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性18周齡的糖尿病肥胖大鼠（實(shí)驗(yàn)組）和非糖尿病健康大鼠（對(duì)照組）大鼠各20只（均由日本山口大學(xué)醫(yī)學(xué)部試驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

2）主要試劑：VEGF測(cè)定試劑、RPMI1640培養(yǎng)基等試劑均由日本山口大學(xué)醫(yī)學(xué)部試驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 骨髓干細(xì)胞的采集及培養(yǎng)

取出大腿骨并把骨髓細(xì)胞單離浮游于PBS溶液中。應(yīng)用比重離心法從骨髓細(xì)胞中分離純化骨髓單核細(xì)胞。把新鮮分離采集的骨髓單核細(xì)胞浮游于RPMI 1640培養(yǎng)基（3×106cells·mL－1）中，并添加15%胎兒牛血清（Gibco）、100U·mL－1青霉素和100μg·mL－1鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2濕化培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.2 細(xì)胞生存的測(cè)定

在細(xì)胞培養(yǎng)第3、7天后取出培養(yǎng)細(xì)胞并用0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液染色后測(cè)出生存的細(xì)胞數(shù)。按培養(yǎng)前的細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出細(xì)胞的生存率。

1.2.3 VEGF濃度的測(cè)定

在培養(yǎng)第3、7天后，取出培養(yǎng)基上清液冷凍保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫標(biāo)記（ELISA）法分別測(cè)定培養(yǎng)基上清液中VEGF的濃度。

1.2.4 骨髓干細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞分化檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)于4井室培養(yǎng)玻片（鋪有0.2mg·mL－1纖維連接蛋白）上，并添加50ng·mL－1VEGF、5ng·mL－1堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和5ng·mL－1胰島素樣生長(zhǎng)因子－1于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)第7天后，用1%福爾馬林固定細(xì)胞并用FITC熒光標(biāo)示的抗VE－cadherin抗體進(jìn)行免疫染色來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生存率

細(xì)胞培養(yǎng)第3天細(xì)胞生存率：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為（30.1±2.4）%、（31.9±3.8）%，2組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)第7天細(xì)胞生存率：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為（18.5±3.1）%、（20.4±1.9）%，2組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 VEGF濃度

培養(yǎng)第3、7天后培養(yǎng)基上清液中VEGF的濃度：實(shí) 驗(yàn) 組 分 別 為 （134.8±27.5）、（282.7±25.2）ng·mL－1，對(duì)照組分別為 （189.1±25.6）、（370.2±40.1）ng·mL－1，2組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 骨髓干細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞分化

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第7天后骨髓干細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞分化率為（14.7±4.5）%，顯著低于對(duì)照組的（32.8±5.6）%（P＜0.01）。

3 討論

本研究顯示糖尿病大鼠的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生血管新生子VEGF的量要比非糖尿病健康大鼠明顯減少。在相同培養(yǎng)條件下，糖尿病大鼠的骨髓細(xì)胞定向分化成內(nèi)皮細(xì)胞的比率也比非糖尿病健康大鼠明顯降低，這些結(jié)果證明了糖尿病可以導(dǎo)致骨髓細(xì)胞的功能低下。其原因和分子機(jī)制還不明白，這有可能是由于糖尿病狀態(tài)下很多炎癥性因子升高而且氧化應(yīng)急增強(qiáng)，抗氧化功能減退［6］，從而影響到骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和干細(xì)胞維持所需因子的改變，最終導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞的凋亡，分化成熟，以及功能低下。

以前的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞數(shù)量減少［7］。由于血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞來(lái)源于骨髓干細(xì)胞，這可能是由于糖尿病引起骨髓干細(xì)胞的功能損害，從而導(dǎo)致骨髓中放出到血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞數(shù)量減少。由于內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞具有修復(fù)血管內(nèi)皮的作用，血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞數(shù)量減少將會(huì)引起受到損害血管內(nèi)皮細(xì)胞得不到及時(shí)修復(fù)，因而產(chǎn)生血栓形成和血管閉塞，也可以說(shuō)明為何在臨床上糖尿病病人并發(fā)缺血性疾病的比率要比健康人高。

盡管本文沒(méi)有使用缺血性動(dòng)物模型對(duì)糖尿病和健康鼠的骨髓細(xì)胞誘發(fā)血管新生作用進(jìn)行比較，但從本文的結(jié)果可以推測(cè)出糖尿病患者的自身骨髓細(xì)胞誘發(fā)血管新生作用可能降低，因而限制了使用糖尿病病人的自身骨髓干細(xì)胞來(lái)治療他們的缺血性疾病或其他疾病。由于目前還不明白糖尿病是如何影響骨髓細(xì)胞功能的分子機(jī)制，因此，下一步的工作應(yīng)該是去揭開(kāi)糖尿病導(dǎo)致骨髓細(xì)胞功能損害的分子機(jī)制之謎，然后找到使其功能得到恢復(fù)的方法。這將會(huì)大大改善糖尿病病人的自身骨髓干細(xì)胞用于誘發(fā)血管新生等治療的效果。同時(shí)，糖尿病病人的骨髓細(xì)胞功能的恢復(fù)也有可能使血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞數(shù)量升高［8］，從而將降低缺血性疾病的并發(fā)率。

綜上所述，糖尿病不僅可以導(dǎo)致骨髓細(xì)胞產(chǎn)生血管新生因子的能力降低而且會(huì)導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞定向分化成內(nèi)皮細(xì)胞的功能低下，這將需要醫(yī)學(xué)工作者對(duì)糖尿病病人在利用自身骨髓干細(xì)胞治療缺血性疾病之前，找到一種有效的方法使其骨髓干細(xì)胞的機(jī)能得到恢復(fù)和改善。

［1］ Kawamoto A，Asahara T，Losordo D W.Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Cardivasc Radiat Med，2002，3：221－225.

［2］ Eriko T Y，Hiroaki M，Toyoaki M，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bone－marrow cells：apilot study and randomized controlled trial［J］.Lancet，2002，360：427－435.

［3］ Jude E B，Oyibo S O，Chalmer N，et al.Peripheral arterial disease in diabetic and nondiabetic patients：a comparison of severity outcome［J］.Diabetes Care，2001，24：1433－1437.

［4］ Hamano K，Nishida M，Hirata K，et al.Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease：clinical trial and preliminary results［J］.Jpn Circ J，2001，65：845－847

［5］ Hirata K，Li T S，Nishida M，et al.Autologous bone marrow cells implantation as therapeutic angiogenesis for ischemic hindlimb in diabetic rat model［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284：H66－H70.

［6］ Sorrentino S A，Bahlmann F H，Besler C，et al.Oxidant stress impairs in vivo reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells from patients with type 2diabetes mellitus：restoration by the peroxisome proliferator－activated receptor－gamma agonist rosiglitazone［J］.Circulation，2007，116（2）：163－173.

［7］ Fadini G P，Sartore S，Albiero M，et al.Number and function of endothelial progenitor cells as a marker of severity for diabetic vasculopathy［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（9）：2140－2146.

［8］ Ii M，Takenaka H，Asai J，et al.Endothelial progenitor thrombospondinK－1mediates diabetes－induced delay in reendothelialization following arterial injury［J］.Circ Res，2006，98（5）：697－704.