羅小瑾 ，尉立京，鄒國平，胡 群

（1.宜春市人民醫(yī)院泌尿外科，江西 宜春 336000；2.山東大學(xué)山東省立醫(yī)院泌尿外科，濟(jì)南 250021）

腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，早期診斷、及時治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前，腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌的術(shù)前診斷主要依靠影像學(xué)檢查和尿細(xì)胞學(xué)檢查［1］。建立快速、特異、非侵入性的檢測方法將有利于腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌的早期診斷，特別對治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)有著重要的意義。為此本研究對腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌患者的手術(shù)摘除標(biāo)本與尿脫落細(xì)胞中存活素（Survivin）［2］的表達(dá)進(jìn)行了分析研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集1995年4月至2010年4月在山東省立醫(yī)院泌尿外科和宜春市人民醫(yī)院泌尿外科住院治療的腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌患者158例。1）根據(jù)WHO行病理分級:腎盂移行細(xì)胞癌113例（腎盂癌組），男 71 例，女 42 例，年齡 35～80 歲，平均 57.8歲。其中Ⅰ級28例、Ⅱ級61例、Ⅲ級24例。輸尿管移行細(xì)胞癌45例（輸尿管癌組），男30例，女15例，年齡40～76歲，平均56.7歲。其中Ⅰ級 11例、Ⅱ級27例、Ⅲ級7例。另選擇腎積水、重復(fù)腎等非腫瘤患者的腎盂標(biāo)本10例作為陰性對照（對照組）。2）選取腎盂移行細(xì)胞癌患者尿脫落細(xì)胞標(biāo)本25例，男16例，女9例，年齡41～66歲，平均54.3歲。 其中Ⅰ級7例、Ⅱ級12例、Ⅲ級6例。輸尿管移行細(xì)胞癌患者尿脫落細(xì)胞標(biāo)本10例，男6例，女4例，年齡40～76歲，平均 56.3歲。其中Ⅰ級3例、Ⅱ級 5例、Ⅲ級2例。另選擇腎積水、重復(fù)腎等非腫瘤患者10例為對照組。所有腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌的診斷均經(jīng)術(shù)后病理證實。

1.2 主要試劑

Survivin單克隆抗體、鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶免疫組化染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 檢測方法

1）手術(shù)標(biāo)本按病理科常規(guī)處理。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白——過氧化物酶連接法（SP法）。常規(guī)石蠟切片、脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)（10 mmol·L－1檸檬酸緩沖液，pH6.0），過氧化氫（H2O2）作用5 min后加Survivin抗體，SP法嚴(yán)格按試劑說明書標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用免疫組化圖像分析系統(tǒng)分析陽性率，測定陽性細(xì)胞吸光值。2）取200 mL新鮮尿液離心棄上清，對沉渣中紅細(xì)胞先用紅細(xì)胞溶解液［氯化銨（NH4CL）155 mmol·L－1、碳酸鉀（K2CO3）10 mmol·L－1、乙二胺四乙酸（EDTA）1 mmol·L－1］作用 5 min 加以破壞，離心，棄上清液，取細(xì)胞沉渣涂片。涂片干燥后用4%多聚甲醛固定5 min，微波抗原修復(fù)，H2O2作用5 min后加Survivin抗體，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)SP步驟進(jìn)行，過氧化物酶顯色。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

Survivin陽性表達(dá)以胞質(zhì)內(nèi)是否出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。高倍顯微鏡下觀察10個視野計數(shù)，計算其陽性表達(dá)的百分率。陰性（－）:陽性細(xì)胞＜10% ；弱陽性（＋）:陽性細(xì)胞≥10%～30%；陽性（?）:陽性細(xì)胞為＞30%～50%；強(qiáng)陽性（?）:陽性細(xì)胞＞50%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Chi－square 和 Fisher’s確切概率法進(jìn)行 χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中Survivin的表達(dá)情況

腎盂癌組113例患者腎盂組織中Survivin陽性表達(dá)68例，陽性表達(dá)率為60.1%，對照組的腎盂組織中陽性表達(dá)率為0.0%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；在輸尿管癌組 45 例患者中，Survivin 陽性表達(dá)25例，陽性表達(dá)率為55.6%，對照組Survivin陽性表達(dá)率為0.0%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Survivin 的表達(dá)率隨著腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌組織的病理分級、分期的升高而增高（P＜0.05或 P＜0.01）；Survivin 的表達(dá)率與性別及年齡無關(guān)（均 P＞0.05）。

2.2 隨訪情況

腎盂癌組113例患者中隨訪超過1年的有93例，20例失訪。93例患者中Survivin陽性者54例，其中24例復(fù)發(fā)，Survivin陽性者復(fù)發(fā)率為 44.4%；Survivin陰性者39例，其中10例復(fù)發(fā)，Survivin陰性者復(fù)發(fā)率為25.6%，2者復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。輸尿管癌組45例患者中隨訪超過1年者有36例，9例失訪。36例患者中Survivin陽性者23例，其中復(fù)發(fā)11例，Survivin陽性者復(fù)發(fā)率為47.8%；Survivin陰性者13例，其中復(fù)發(fā)4例，urvivin陰性者復(fù)發(fā)率為30.76%，2者復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腎盂癌組隨訪超過 5 年者 41例，其中 Survivin 陽性 23 例，5 年生存率為 34.8%（8／23）；Survivin 陰性 18 例，5 年生存率為 55.6%（10／18），2組生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。輸尿管癌組隨訪超過5年的19例，其中Survivin陽性11例，5 年生存率為 36.4%（4／11），Survivin 陰性 8 例，5 年生存率為 62.5%（5／8），但 2 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 尿脫落細(xì)胞涂片中Survivin的表達(dá)

腎盂癌組25例患者行尿脫落細(xì)胞涂片，24例Survivin陽性表達(dá)，陽性率為96.0%；輸尿管癌組10例患者行尿脫落細(xì)胞涂片，Survivin表達(dá)均為陽性，陽性率為100.0%；對照組10例患者尿脫落細(xì)胞Survivin表達(dá)均為陰性。腎盂癌組、輸尿管癌組Survivin表達(dá)陽性率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。尿脫落細(xì)胞Survivin檢測診斷腎盂和輸尿管移行上皮細(xì)胞癌的敏感性與特異性分別為 96.0%和 100.0%。

3 討論

Survivin是1997發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，它具有2種功能:抑制細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子［2］。Survivin主要通過3種方式直接或間接抑制Caspase活性而抗凋亡［2］，其表達(dá)具有細(xì)胞周期性，只在G2／M期表達(dá)。在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達(dá)，而在除胚胎期外的正常組織中（胎盤和胸腺除外）均不表達(dá)。Survivin與膀胱移行細(xì)胞癌關(guān)系的研究較多，也有了很大的進(jìn)展，它的高敏感性和高特異性已引起了泌尿外科醫(yī)生的注意。本研究中的尿液Survivin蛋白檢測為腎盂癌和輸尿管癌的診斷提供了一種高敏感性、高特異性和無創(chuàng)的檢測指標(biāo)，其敏感性為96.0%，特異性為 100%［3］。本研究結(jié)果表明:Survivin在各級腎盂移行細(xì)胞癌和輸尿管移行細(xì)胞癌中均有不同程度的表達(dá)，是判斷腎盂移行細(xì)胞癌和輸尿管移行細(xì)胞癌的標(biāo)志物。

腎盂移行細(xì)胞癌和和輸尿管移行細(xì)胞癌均是泌尿外科的常見疾病，臨床癥狀以全程無痛性肉眼血尿為主，但有時也以腰痛、乏力、發(fā)熱等為始發(fā)癥狀，即使目前輔助檢查多樣，但有時仍然很難與腎結(jié)核、腎癌、黃色肉芽腫性腎盂腎炎、輸尿管結(jié)石相鑒別。而膀胱癌患者有膀胱鏡檢查作為診斷膀胱移行上皮細(xì)胞癌的金標(biāo)準(zhǔn)［4］，所以筆者認(rèn)為對疑有腎臟占位的患者，如果腎盂移行細(xì)胞癌的可能性大，但同時又不好與其他占位性病變相鑒別，可以查尿中Survivin的表達(dá)，如果Survivin為陽性可以在排除膀胱癌及輸尿管移行細(xì)胞癌的情況下，診斷為腎盂移行細(xì)胞癌，為決定治療方案提供很好的證據(jù)。如果患者輸尿管擴(kuò)張伴實性病變則可以通過CT或MR，輔助檢測尿液中Survivin的表達(dá)，能及時地發(fā)現(xiàn)輸尿管移行細(xì)胞癌。

腎盂移行細(xì)胞癌及輸尿管移行細(xì)胞癌與Survivin的關(guān)系，目前國內(nèi)外報道甚少。由于腎盂輸尿管移行細(xì)胞癌與膀胱移行細(xì)胞癌起源相同，都是泌尿系移行細(xì)胞。近年來雖有一些新的方法可以直接從尿液標(biāo)本中得出診斷指標(biāo)，但由于其對Ⅰ級腎盂移行細(xì)胞癌存在特異性與敏感性不高的缺陷而未能在臨床上推廣應(yīng)用［5］。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，它具有2種功能:抑制細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［2］，在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達(dá)，而在除胚胎期外的正常組織中都不表達(dá)（胎盤和胸腺除外）［2］。這種特異性表達(dá)使人們把它和惡性腫瘤的診斷聯(lián)系了起來。本研究結(jié)果表明，Survivin在各級腎盂移行細(xì)胞癌和輸尿管移行細(xì)胞癌中均有不同程度的表達(dá)，Survivin的表達(dá)使移行細(xì)胞癌的凋亡受到抑制［6］，對化療與放療的抵抗性增強(qiáng)［7］。這些因素是否與腎盂輸尿管移行細(xì)胞癌的高復(fù)發(fā)率直接有關(guān)還未能明了。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ級腎盂移行細(xì)胞癌和Ⅲ級輸尿管移行細(xì)胞癌組織中Survivin表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，故認(rèn)為Survivin與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)。本研究對10例非泌尿系統(tǒng)腫瘤患者及25例腎盂移行細(xì)胞癌患者中尿脫落細(xì)胞行Survivin檢測，診斷腎盂移行細(xì)胞癌的敏感性為96.0%、特異性為100.0%，10例輸尿管移行細(xì)胞癌中尿脫落細(xì)胞Survivin檢測診斷輸尿管移行細(xì)胞癌的敏感性為100%、特異性為100%。因此，這一方法可作為腎盂移行細(xì)胞癌和輸尿管移行細(xì)胞癌的早期診斷及治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)的指標(biāo)，可提高腫瘤細(xì)胞的檢出率，尤其對Ⅰ級腎盂輸尿管移行細(xì)胞癌。用Westernblot和逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法可以測出尿脫落細(xì)胞中Survivin的存在，用ELISA方法測定Survivin抗體的濃度來診斷腫瘤，目前也處在實驗階段［8］。從尿脫落細(xì)胞涂片中觀察Survivin的表達(dá)，標(biāo)本容易收集，采用常規(guī)的免疫組化方法即可直接檢測到Survivin，方法簡單，而且尿液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞對本檢測無干擾。所以筆者認(rèn)為，本法作為診斷腎盂輸尿管移行細(xì)胞癌的篩選方法，但必須要有陰性和陽性對照以減少假陽性和假陰性，特別是Ⅰ級腎盂輸尿管移行細(xì)胞癌標(biāo)本中Survivin表達(dá)濃度低，如果不重視陰性和陽性對照就會影響檢測的準(zhǔn)確性。

［1］Brown G A，Matin S F，Busby J E，et al.Ability of clinical grade to predict final pathologic stage in upper urinary tract transitional cell carcinoma:implications for therapy［J］.Urology，2007，70（2）:252－256.

［2］Ambrosini G，Adida C，Altieri D C.A novel anti－apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma ［J］.Nature Med，1997，3（8）:917.

［3］Duffy M J，O’Donovan N，Brennan D J，et al.Survivin:a promising tumor biomarker［J］.Cancer Lett，2007，249（1）:49－60.

［4］Singh R P，Tyagi A，Sharma G，et al.Oral silibinin inhibits in vivo human bladder tumor xenograft growth involving downregulation of surviving［J］.Clin Cancer Res，2008，14（1）:300－308.

［5］Pennati M，F(xiàn)olini M，Zaffaroni N.Targeting survivin in cancer therarpy［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12（4）:463－476.

［6］Wang X L，Hou J Q，Wen D G，et al.Effects of survivin small interfering RNA on biological behaviors of bladder cancer T24 cells［J］.Ai Zheng，2008，27（3）:253－257.

［7］Ma A C，Lin R，Chan P K，et al.The role of survivin in angiogenesis during zebrafish embryonic development［J］.BMC Dev Biol，2007，7:50.

［8］Tian B，Wang Z，Zhao Y，et al.Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model［J］.Cancer Lett，2008，264（2）:299－308.