王文俊，畢江華，仝太軍

（1.新疆阿勒泰市哈巴河縣薩爾塔木鄉(xiāng)獸醫(yī)站 836702；2.北京安伯胚胎生物技術中心 100107）

淺淡我國改變牛性別比例技術的研究概況

王文俊1，畢江華2，仝太軍2

（1.新疆阿勒泰市哈巴河縣薩爾塔木鄉(xiāng)獸醫(yī)站 836702；2.北京安伯胚胎生物技術中心 100107）

現(xiàn)代農業(yè)生產中，人們常常期望得到某一特定性別的家畜。如在奶牛場，生產者希望母牛所生的犢牛全是雌性，給牛場帶來更高的經(jīng)濟價值。然而，在自然狀態(tài)下，動物的性比總是遵循公母1∶1的規(guī)律，始終保持平衡，如何打破自然界的性比規(guī)律，獲得理想的公母比例有很重要的意義。為此，人們嘗試了很多種方法對動物性別進行控制。本文對此進行綜述，以期對畜牧生產有所幫助。

1 性別控制概況

目前，性別控制技術主要有三大類：（1）通過對X、Y精子的分離，結合人工授精，控制后代性別；（2）對早期胚胎進行鑒定，結合胚胎移植技術；（3）調控受精環(huán)境技術。由于X、Y精子分離技術的相關研究報道很多，因此，本文將重點比較和討論后兩類中的常用技術在性別控制中的應用概況。

1.1 早期胚胎的性別鑒定

應用于哺乳動物早期胚胎性別鑒定的方法主要有：細胞遺傳學方法、生物化學微量分析法、免疫學方法和分子生物學方法等。應用分子生物學法中的PCR擴增法是一種比較理想和可靠的鑒定方法。采用PCR擴增對胚胎進行性別鑒定，同時結合胚胎冷凍保存、胚胎移植等配套技術，可實現(xiàn)對家畜的性別控制，現(xiàn)已被廣泛應用于牛胚胎產業(yè)化生產中。

自1990年英國學者Sinclair等[1]發(fā)現(xiàn)哺乳動物Y染色體短臂上存在性別決定區(qū)（Sex Determining Region of the Y chromosome，SRY）以來，許多學者在這方面進行了深入的研究。PCR法（聚合酶鏈式反應）的實質就是Y染色體特異性片段或Y染色體上的性別決定基因（SRY）的檢測技術，即通過合成SRY基因或其它Y染色體上的特異性片段的部分序列作為引物，用少部分胚胎細胞中的DNA為模板，在一定條件下進行PCR擴增反應，能擴增出目標片段的胚胎為雄性胚胎，否則為雌性胚胎[2]。目前常用的牛胚胎性別鑒定的PCR方法主要有兩種：一種為常規(guī)PCR，即用一對Y-染色體特異性引物或同時使用一對公、母牛共有基因引物作為內標引物對胚胎樣品進行一次PCR擴增來鑒定胚胎性別；另一種為巢式PCR，即先用Y-染色體特異基因的外引物和內標引物進行第1次PCR擴增，然后取第1次擴增產物再加入內引物和內標引物進行第2次擴增。

我國曾溢滔等[3]于1993年首先用DNA測序直接檢測到牛SRY基因的核心序列，同時設計合成僅特異于牛SRY基因的2對PCR寡核苷引物，對17枚奶牛胚胎用不同的引物2次擴增進行性別鑒定，性別符合率為100%；鑒定后有4枚胚胎移植成功，其產犢結果均與胚胎性別鑒定結果相符合。1994年，羅應榮等[4]用所設計的引物，對10頭奶牛血液樣品和胚胎細胞中染色體擴增，結果表明擴增對已知性別的牛血液樣品和同一胚胎的不同樣品結果完全符合；在奶牛場采集新鮮胚胎，用玻璃針法切取數(shù)個細胞，用PCR方法鑒定后移植，有7頭犢牛出生，其性別與PCR鑒定結果完全一致。隨后，胡明信[5]，楊建明[6]，呂碧文[7]等也進行了這方面的研究，獲得了較高的準確率。2003年，陳從英[8]等根據(jù)牛SRY基因自行設計引物分別用常規(guī)PCR和巢式PCR對牛早期胚胎進行性別鑒定，其鑒定結果與實際完全一致。但是這種傳統(tǒng)的PCR性別鑒定，從設計引物到提取胚胎細胞的DNA再到擴增，其耗時長、易污染、取樣方法對胚胎移植妊娠率也造成了很大的影響。因此，研究人員通過不斷尋找適合的牛雄性特異性引物，探索活檢細胞的數(shù)量，縮短性別鑒定所需的時間等方面進行研究來解決其在實際生產中的可用性。朱化彬[9]，洪桂云[10]，張莉[11]等針對傳統(tǒng)PCR的缺陷，通過研究優(yōu)化胚胎DNA擴增條件和PCR性別鑒定技術體系，提高了整個性別鑒別時間，并且保證了鑒定可靠性。但到目前為止，國內的PCR性別鑒定技術往往只能在實驗室進行，PCR性別鑒定試劑盒并未能進行商品化生產，這極大地限制了其在畜牧業(yè)上的應用。李樹靜等[12]利用胚胎切割儀和倒置顯微鏡對85枚胚胎取樣，將樣品置于液氮后，應用美國AB Technology公司提供的專利產品YCD（Y-chromosomal Determinant）試劑盒，用 PCR 技術對樣品進行鑒定，鑒定出52枚雌性胚胎后移植，產28個母犢，產犢率52.7%，鑒定準確率達到100%；移植180枚非鑒定胚胎，產犢率52.7%，與取樣后胚胎的產犢率無顯著差異。此次PCR胚胎性別鑒定技術在生產中的應用模式初探為我國牛胚胎移植技術應用于奶牛純繁提供了平臺。

1.2 調控受精環(huán)境技術

染色體理論并非性別決定機制的全部，外部環(huán)境中的某些因素也是性別決定機制的重要條件。

1.2.1 控制輸精時間 由于Y精子的游速快于X精子，如果提早（排卵前）輸精，Y先期到達受精部位，等到卵子到達時，Y精子已接近失活；相反，X精子運動慢，且壽命長，在這時X精子活力遠遠大于Y精子，有利于X精子與卵子的結合，提高產母犢率。陳元明[13]試驗證明，適時授精性控法能使產犢牛的性別與授精當時預測子代牛性別的符合率達到約70.8%。畢江華等[14]報道，在超排處理供體奶牛發(fā)情后8～11 h，12～15 h和16～19 h采用常規(guī)凍精法第1次配種，12 h后第2次配種，獲取胚胎后采用PCR法鑒定，16～19 h組雌性胚率最低為45.2%，8～11 h組和12～15 h組分別為47.0%和48.6%，3組間雌性胚率差異不顯著，但隨著輸精時間的推遲，雌性率下降。

1.2.2 調整子宮頸內黏液的pH值 Y精子對酸性環(huán)境的耐受力比X精子差，當母牛生殖道內的pH值較低時，Y精子的活力減弱，失去較多的與卵子結合的機會，故后代雌性較多。李秀山等[15]對實驗組正常發(fā)情的奶牛在輸精前15～20 min向子宮頸內3 cm處輸入1 mL 5%精氨酸制劑，產犢46頭，其中母犢34頭，母犢率為73.9%。胡春山等[16]用兩年多的時間（1986～1987）重復應用5%精氨酸溶液控性輸精試驗，產母犢率分別為72.22%和55.55%。王光輝等[17]用5%L型精氨酸注入母牛子宮內，并對母牛的生母率和子宮頸內黏液的pH值進了測定。結果表明，子宮頸黏液pH值在7.16±0.28、8.06±0.32和7.76±0.52時，生母率分別為78.5%、18.75%和47.90%。精氨酸處理的奶牛兩年的生母率平均為63.8%，比對照組提高15.8%，差異極顯著。謝獻勝等[18]向隨機分組的268頭發(fā)情奶牛子宮內上1/3處分別注入5%和8%的精氨酸1 mL，分別在15 min和20～30 min后給母牛輸精，其中，5%精氨酸處理、20～30 min后輸精的試驗組，母牛產雌犢的比率達73.77%，比對照組提高25.46個百分點，差異極顯著。張永春等[19]采用3種濃度（4.5%、5.5%和6.5%）的精氨酸對108頭奶牛進行產母犢率試驗，結果顯示，試驗組比對照組提高8.9%～13.34%，以5.5%精氨酸濃度最為明顯，兩者差異顯著，而試驗組之間差異不顯著。

2 總結

2.1 PCR性別鑒定和胚胎移植技術為提高優(yōu)秀母畜繁殖力提供了有利的保障，已經(jīng)開始在我國應用。目前國內商業(yè)化應用采用的是進口PCR鑒定試劑盒，由于其售價太高，限制了該技術的普及，因此研制自主產權的性別鑒定試劑盒已迫在眉睫。

2.2 應用PCR性別鑒定技術，胚胎切割取樣是關鍵環(huán)節(jié)之一，但目前國內掌握此項技術的人員數(shù)目有限，因此，加強培養(yǎng)相關技術熟練人員已成必要。

2.3 通過控制牛的受精環(huán)境來實現(xiàn)性別控制雖然有一定的效果，但其重復性太差，因此對該法的推廣應用價值仍有爭議。

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