郝 鵬,王 紅,解廣勤,胡建宏＊,楊海濤,賈永宏

(1.陜西省家畜改良站,陜西涇陽 713702;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院 ,陜西 楊凌 712100; 3.武警陜西省總隊后勤部農(nóng)副業(yè)基地,陜西西安 712200)

早在20世紀50年代左右,英國、丹麥、美國、日本等畜牧業(yè)發(fā)達國家普遍推行牛的人工授精技術(shù)。我國牛的人工授精技術(shù)于20世紀70年代在生產(chǎn)中得到普及推廣,對促進我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重大作用。牛精液的冷凍保存在家畜冷凍精液研究中最為成功,尤其是目前所有的奶牛場均利用冷凍精液,通過人工授精技術(shù)繁育后代。雖然如此,我國牛冷凍精液的研究水平與國外同類研究相比比較落后,精子活率低于國外標(biāo)準(zhǔn)。本文就牛冷凍精液的發(fā)展歷程以及牛精液冷凍保護劑和評定指標(biāo)等進行綜述,以期對牛冷凍精液的研究有所借鑒,進一步提高牛冷凍精液的質(zhì)量。

1 牛冷凍精液的發(fā)展歷程

家畜精液冷凍保存最早可追溯到1776年,意大利人Spallanzanei首先發(fā)現(xiàn)自然界中的低溫物質(zhì)(冰雪)可對人精子的活動狀態(tài)產(chǎn)生影響。1949年,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了甘油對雞精液的冷凍保護作用,促使精液的冷凍保存技術(shù)取得了較大進展。隨后Polge和Smith等[1]對牛羊精液進行了試驗,發(fā)現(xiàn)稀釋液中加入15%～20%的甘油,并以10℃/min的降溫速度由0℃緩慢降至-79℃時,精子存活率會有很大提高。

1950年,美國用經(jīng)冷凍過的良種公牛精液給38頭母牛輸精,懷孕率為79%,并首次獲得來自冷凍精液的犢牛,這是家畜中最早利用冷凍精液進行人工授精獲得成功的報道。雖然后來人們又做了大量的輸精試驗,但受胎率很低。為了提高冷凍精液輸精時母牛的受胎率,Polge和Rowso等[2]通過改變精液的處理程序,極大地提高了精子的存活率和受胎率。冷凍—解凍后精子的復(fù)蘇率可達70%～80%,并用-79℃冷凍保存2 h至8 d后的精液給38頭母牛輸精,其中30頭受胎。Polge[3]以冷凍保存1～5周的精液輸精208頭母牛,平均受胎率達65%。從此以后,許多科學(xué)家就稀釋液配方、稀釋倍數(shù)和稀釋方法、甘油濃度、精液平衡溫度和時間、降溫速度以及解凍方法等精液冷凍的各個步驟進行了大量研究,致使冷凍精液的應(yīng)用取得快速發(fā)展。精液的超低溫冷凍保存技術(shù)越來越受到各國的重視,許多國家相繼建立了牛、豬、羊及人類的精子庫。

2 牛精液冷凍保存的基本原理

精子具有受溫度變化直接影響其本身活動力和代謝能力的生物學(xué)特性[4]。精子保存在超低溫狀態(tài)下,其代謝活動完全受到抑制,生命以相對靜止?fàn)顟B(tài)保持下來,一旦升溫又能復(fù)蘇而不失去受精能力。精子之所以能夠復(fù)蘇的關(guān)鍵在于精液在冷凍過程中,在冷凍劑的保護下,防止了精子水分冰晶化對精子的破壞,而盡可能形成玻璃化。

冰晶化是水在降溫過程中的一定溫度條件下,水分子重新按照幾何圖形排列形成冰晶的過程。冰晶改變了精子膜的溶質(zhì)濃度和滲透壓,造成精子脫水,發(fā)生不可逆的化學(xué)毒害而死亡。冰晶化只有當(dāng)溫度在0～-60℃溫度范圍內(nèi)緩慢降溫時形成,降溫越慢冰晶越大,-15～-25℃形成冰晶最多。玻璃化的冰凍狀態(tài)是水在超低溫下,水分子仍然保持原來自然的一種無次序的排列狀態(tài),形成玻璃樣的堅硬而均勻的冰結(jié)[5]。在此狀態(tài)下,精子不會發(fā)生細胞脫水,結(jié)構(gòu)維持正常。為避免冷凍過程中精子發(fā)生冰晶化,必須盡快通過危險溫區(qū),形成玻璃化凍結(jié)。該過程具有不穩(wěn)定的可逆性,精液冷凍的降溫和升溫均應(yīng)快速處理。

3 牛冷凍精液的冷凍保護劑

甘油作為稀釋液中常用的冷凍保護劑,一方面對精子有保護作用,另一方面又對精子具有損傷作用,因而新型抗凍劑的開發(fā)一直備受關(guān)注。昝林森等[6]研究證明,海藻糖和牛血清白蛋白單獨和配伍使用都能對凍后精子品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響;胡傳活等[7]探索了乳鐵蛋白在牛精液冷凍中的效果,發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白對精子凍后活力、運動性能、畸形率、頂體完整率及質(zhì)膜完整性均沒有顯著影響。冷凍稀釋液充當(dāng)精子載體的作用,包含很多能夠調(diào)節(jié)精子受精能力的因子,并為精子提供代謝物質(zhì)的功能。因此,對精子稀釋液的組成物質(zhì)以及精子與環(huán)境物質(zhì)的作用關(guān)系,有必要進行更多研究。

由于使用動物冷凍保護劑可能導(dǎo)致疾病的傳播與病菌的感染,近年來科學(xué)家一直在探索使用植物冷凍保護劑。Moussa等[8]報道,以蛋黃中提取的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黃冷凍牛精液,其效果比商業(yè)用的稀釋液好。Bucak等[9]研究了蛋氨酸、肌醇和肉堿對凍融后牛精子各種參數(shù)(活力、異常率、DNA的完整性和受胎率)和氧化應(yīng)激指標(biāo)(脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽和總抗氧化能力水平)的作用。結(jié)果表明,在冷凍前添加抗氧化劑可以維持精子DNA的完整性,使其免受冷凍損傷。Tuncer等[10]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽對凍融后牛精子氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。結(jié)果表明,半胱氨酸和谷胱甘肽對精子形態(tài)并沒有顯著的影響,但可以降低冷凍過程對精子DNA的損害。Ansari等[11]研究證明,在稀釋液中添加丁羥甲苯可以顯著提高牛精液活力、質(zhì)膜完整性和生存能力。

Hu等[12,13]發(fā)現(xiàn),牛冷凍精液稀釋液中添加維生素B12可以顯著提高精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率,而添加LDL顯著增加線粒體活性、頂體完整、膜的完整性以及DNA完整性。為了提高精子的抗氧化能力,Hu等[14,15]在牛冷凍稀釋液中添加維生素,發(fā)現(xiàn)可以有效減少由冷凍-解凍造成的氧化應(yīng)激,從而提高牛精子的凍后品質(zhì)。同時表明,抗氧化體系中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)對維持牛精子的活力和運動能力發(fā)揮重要作用。Hu等[16]檢測了海藻糖對牛精液質(zhì)量和凍融后抗氧化活性的影響。結(jié)果證明,稀釋液中添加海藻糖可以降低由凍融引起的氧化應(yīng)激,從而提高冷凍-解凍后的牛精液品質(zhì)。

4 牛冷凍精液的質(zhì)量檢測

目前已經(jīng)有很多種方法檢測精子的質(zhì)量,諸如精子活力、精子形態(tài)、精子存活時間等[4]。常規(guī)精液檢測主要包括精子形態(tài)、精子濃度和精子活力三個部分。計算機輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)是近些年推出的利用計算機輔助精子運動圖像分析儀來檢測精子質(zhì)量的技術(shù)。該系統(tǒng)操作簡單、客觀、快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高,能分析與精子運動功能相關(guān)的多種參數(shù)。流式細胞儀是檢測精子質(zhì)量的一種新的方法,與傳統(tǒng)的光學(xué)檢測或熒光顯微鏡染色技術(shù)相比,流式細胞儀檢測冷凍-解凍后精子的質(zhì)量具有高通量、準(zhǔn)確和簡便等特點。檢測指標(biāo)比較全面,能夠充分反應(yīng)精子的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)。當(dāng)然,預(yù)測精子受精能力的最好評估手段是IVF試驗,即在體外條件下讓解凍后精子按一定的比例與卵母細胞共同孵育,檢查其第一極體排出率、2～4細胞發(fā)育率、囊胚和擴張囊胚發(fā)育率等指標(biāo),并建立這些指標(biāo)與母牛不返情率之間的相關(guān)性。在評定凍后精子的受精能力時,通過這些指標(biāo)的測定,對于預(yù)測使用冷凍精液人工授精后母牛的不返情率、受胎率等具有重要意義。精子各項質(zhì)量指標(biāo)之間具有很強的相關(guān)性,利用其相關(guān)性客觀準(zhǔn)確的綜合評定凍后精子質(zhì)量,可為牛冷凍精液的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

雖然牛冷凍精液的研究相對比較成功,應(yīng)用也比較廣泛,但一般的研究僅僅涉及不同稀釋液對精液冷凍質(zhì)量的影響,來探求最好的冷凍稀釋液配方。關(guān)于稀釋液中不同成分提高精子活力的機理,影響精子凍后活力的基因與蛋白及其相互作用和表達的信號途徑等,相對研究較少,從而對其作用機理不甚清楚。特別是我國牛冷凍精液的研究水平與國外相比仍然存在較大差距,例如目前國內(nèi)生產(chǎn)的細管凍精解凍后精子活率僅達到30%左右,遠遠低于國外活率達到50%的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。因此,我們要進一步加大研究力度,建立精子低損傷冷凍技術(shù),切實提高牛冷凍精液的質(zhì)量水平。牛精液冷凍技術(shù)與人工授精、體外授精、性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)的有機結(jié)合,在新世紀必將對我國地方低產(chǎn)品種改良、保護優(yōu)良種質(zhì)資源以及大力發(fā)展畜牧業(yè)、提高人們的生活水平、拉動區(qū)域經(jīng)濟騰飛等發(fā)揮巨大作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Smith A U,Polge C.Survival of spermatozoa at low temperatures[J].Nature,1950.166(4225).668-669.

[2] Willadsen S,Polge C,Rowson L E A.Viability of deep-frozen cow embryos[J].Journal of Reproduction and Fertility,1978. 52(2):391-393.

[3] Polge C.Low-temperature storage of mammalian spermatozoa [J].Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences,1957,147(929):498-507.

[4] 楊利國主編.動物繁殖學(xué).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003.

[5] Luyet B J,Hodapp R.Revival of frog spermatozoa vitrifed in liquid air[J].Proc.Soc.Exp.Biol.1938.NY 39,433-434.

[6] 昝林森,張鶯鶯,耿繁軍,等.海藻糖和牛血清白蛋白對牛精液的冷凍效果[J].西北農(nóng)林科技學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,36 (10):52-58.

[7] 胡傳活,胡傳水,莊新杰,等.乳鐵蛋白對牛精液冷凍效果的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(36):11849-11850.

[8] Moussa M,Martinet V,T rimeche A,et al.Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method:cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen[J].Theriogenology,2002,57:1695-1706.

[9] Bucak M N,Tuncer P B,Sariozkan S,et al.Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress parameters:Antioxidants protect DNA integrity against cryodamage [J].Cryobiology,2010,61(3):248-253.

[10] T uncer P B,Bucak M N,Buyukleblebici S,et al.The effect of cysteine and glutathione on sperm and oxidative stress parameters of post-thawed bull semen[J].Cry obiology,2010,61 (3):303-307.

[11] Ansari M S,Rakha B A,Akhter S.Effect of Butylated Hydroxytoluene Supplementation in Ex tender on Motility, Plasmalemma and Viability of Sahiwal Bull Spermatozoa[J]. Pakistan Journal of Zoology,2011,43(2):311-314.

[12] Hu J H,Tian W Q,Zhao X L,et al.T he Cryoprotective Effects of Vitamin B-12 Supplementation on Bovine Semen Quality[J].Reproduction in Domestic Animals,2011,46 (1):66-73.

[13] Hu J H,Jiang Z L,Lv R K,et al.The advantages of low-density lipoproteins in the cryopreservation of bull semen[J]. Cryobiology,2011,62(1):83-87.

[14] Hu J H,Tian W Q,Zhao X L,et al.The cryoprotective effects of asco rbic acid supplementation on bovine semen quality[J].Animal Reproduction Science,2010,121(1-2):72-77.

[15] Hu J H,Zan L S,Zhao X L,et al.Effects of trehalose supplementation on semen quality and oxidative stress variables in frozen-thawed bovine semen[J].Journal of Animal Science, 2010,88(5):1657-1662.

[16] Hu J H,Zhao X L,Tian W Q,et al.Effects of vitamin E supplementation in the extender on frozen-thawed bovine semen preservation[J].Animal,2011,5(1):107-112.