黎仁軍,苗永旺

(云南農業(yè)大學動物科學與技術學院,云南昆明 650201)

肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)又稱GDF-8(grow th differentiation factor 8,生長分化因子8),屬 TGF-β(transforming growth factor beta,轉化生長因子β)超家族,是在骨骼肌中廣泛表達的一種糖蛋白,其生物學功能變化會通過調節(jié)靶基因的表達,改變肌肉的纖維組成并造成肌肉重量的變化。肌肉生長抑制素基因是由美國John Hopkins大學醫(yī)學院Mepherron和Lee等的研究小組在研究轉化生長因子β家族時發(fā)現(xiàn)的一種生長分化因子[1]。Kambadur發(fā)現(xiàn)雙肌牛中MSTN基因發(fā)生突變,結果在同樣喂食條件下,雙肌牛比普通牛多提供30%的肉產品[2]。由于GDF-8對骨骼肌的生長具有負調控作用,所以又命名為肌生成抑制素。該因子在生物醫(yī)學和畜牧業(yè)等具有很大的潛在應用價值,所以一經發(fā)現(xiàn)就受到科學工作者的廣泛重視,現(xiàn)而今已成為分子生物學領域的一個研究熱點。

1 MSTN基因的發(fā)現(xiàn)

早在十九世紀人們就發(fā)現(xiàn)了具有雙肌性狀的牛,由于這種牛具有瘦肉率高、屠宰率高等特點,因此人們對雙肌性狀的起因、結構特點、遺傳機制等進行了相關的研究。直到1997年,McPherron等通過篩選小鼠的骨骼肌cDNA文庫而得到全長的cDNA序列,分析得出小鼠MSTN基因cDNA序列中只有一個開放閱讀框架(opening reading frame,ORF),編碼376個氨基酸,具有TGF-β超家族的典型結構,但與其它 TGF-β家族成員的同源性很低(最高為45%),因而被歸為新一類命名為GDF-8[1,3,4]。利用基因敲除技術使小鼠的GDF-8的C-端生物活性區(qū)缺失,得到的缺失純合體小鼠可以存活并能夠生育,其體重要比雜合型和野生型小鼠重約30%,單塊肌肉的重量為野生型小鼠的2～3倍[5]。因此根據(jù)該基因具有抑制肌肉發(fā)育的功能和表達的組織特異性,將其命名為肌肉生長抑制素基因[6]。

2 MSTN基因的結構特點

MSTN基因編碼的蛋白質是TGF-β的一員,它具有TGF-β超家族的典型結構特點:其氨基酸序列有家族特征,在MSTN蛋白的N-末端有相同的非親水性氨基酸序列作為分泌信號;一般有9個半胱氨酸位于C-末端形成“半胱氨酸節(jié)點”;其C-末端通過形成二硫鍵組成具有生物學活性的二聚體發(fā)揮其功能且C-末端都有保守的由四個氨基酸Arg-Ser-Arg-Arg(RSRR,第263～266位)組成的蛋白酶加工位點[7]。

迄今為止,已經通過染色體遺傳和物理圖像分析對牛的MSTN基因進行了染色體定位,該基因位于:牛2q11[8,9]。牛MSTN基因第1和第2外顯子的長度分別為506 bp和374 bp,第3外顯子的長度由于poly(A)尾巴位點的不同而有所差異,分別為1 701,1 812或1 887個核苷酸,兩個內含子的長度分別為1 840 bp和2 033 bp[10]。Marcq等分析了比利時Texel(特塞爾綿羊)雙肌綿羊的遺傳機制,其MSTN基因的編碼區(qū)與普通綿羊沒有堿基差異。采用該基因側翼的微衛(wèi)星標記進行連鎖分析表明,在綿羊染色體2遠端區(qū)存在1個對肌肉的發(fā)育產生效應的 QT L(quantitative trait loci,數(shù)量性狀位點),該座位很可能就是MSTN基因。劉錚鑄[5]利用PCR方法擴增得到了山羊的MSTN基因5 211 bp的DNA序列,包括了該基因的完整編碼區(qū)。有3個外顯子和2個內含子,外顯子的大小分別為:373 bp、374 bp 、381 bp;內含子分別 為 1 834 bp 、2 027 bp。

3 MSTN基因的作用機制

在哺乳動物中,MSTN主要在骨骼肌中表達,并且在生長時期和成熟期的骨骼肌中均有表達。和其他TGF-β成員一樣,MSTN基因也是先合成前體蛋白,經二次蛋白酶酶解活化,將MSTN基因表達產物分泌到胞外,之后形成的前肽在RSRR區(qū)被切除N端約266個氨基酸,剩成熟區(qū)109個氨基酸以二硫鍵的方式結合成二聚體,再和膜上的特異性受體發(fā)生作用,通過三種Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)介導,將信號傳到細胞核,最后調節(jié)靶基因的表達從而對骨骼肌纖維數(shù)量和粗細進行調節(jié)。

為了驗證MSTN具有抑制肌細胞生長的作用,Taylor[11]等在2001年研究檢測了重組MSTN基因對鼠骨骼肌細胞的影響,結果發(fā)現(xiàn)重組MSTN基因編碼的蛋白可抑制細胞的增生、DNA的合成以及蛋白質的合成,從而抑制肌肉的生長。2002年Langley[12]等探討了MSTN基因抑制成肌細胞分化,并闡述了這種抑制作用是通過Smad3介導的。體外實驗向低血清濃度培養(yǎng)的成肌細胞中增加MSTN融合蛋白可以可逆的阻斷成肌細胞的分化。分析表明MSTN可以使MyoD(Myogenic Differentiation Antigen,成肌分化抗原),Myf5(Myogenic regulatory factor 5,成肌調節(jié)因子5)和Myogenin(肌細胞生成素)等肌肉調節(jié)因子水平下降,從而抑制成肌細胞的分化。

4 MSTN基因的研究進展

4.1 MSTN基因的表達研究

MSTN基因在動物的不同發(fā)育時期和不同物種間的表達不同,在哺乳動物中,MSTN在胚胎發(fā)育時期和成年個體骨骼肌中均有表達。在牛胚胎中,從第15 d到第29 d都能檢測到少量MSTN基因的mRNA,但是第31 d后mRNA的量會逐漸增加。Ferec[14]等運用定量RT-PCR技術分析了初生牛中該基因的表達,在股二頭肌和半肌腱中該基因在出生后1 d表達水平最高,第8 d和第14 d后慢慢降低。而在排腸肌中該基因在出生后第14 d表達水平最高,第8 d后最低。除了在骨骼肌中有表達外還發(fā)現(xiàn)其他組織中也有MSTN基因的表達,只是含量較低。Sharma[13]等發(fā)現(xiàn)在牛和綿羊的心肌組織中檢測到MSTN蛋白。在脂肪組織發(fā)現(xiàn)也有表達,暗示其可抑制前成脂肪細胞(preadipocyte)分化[14]。Casas[15]等研究了從比利時蘭牛與MARCⅢ(1/4Angus,1/4Hereford,1/4Red poll,1/4Pinzgauer)的雜交牛、皮埃蒙特(Piedmontese)與安格斯(Angus)的雜交牛這兩個半同胞家系中分離出MSTN的純化拷貝型與數(shù)量性狀座位的互作效應,發(fā)現(xiàn)5號染色體與肌肉的剪切嫩度有關,14號染色體與脂肪厚度有關。郭丹[16]等采用PCR-SSCP方法對草原紅牛(Grassland Red)和利木贊牛(Limousin)與草原紅牛的雜交牛進行了單核苷酸多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)282位堿基發(fā)生突變,由C突變?yōu)锳,導致編碼的氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?這與Grobet于1998年發(fā)現(xiàn)歐洲利木贊牛的MSTN基因第1外顯子的突變相符。并且檢驗了不同性狀在該點不同基因型間的顯著性,結果表明等位基因B可以顯著的提高草原紅牛的日增重、屠宰率、凈肉率和肉骨比。

4.2 MSTN基因的突變及多態(tài)性研究

以產肉多而聞名的比利時蘭牛(Belgian blue)和皮埃蒙特牛中雙肌表型發(fā)生頻率最高,其中比利時蘭牛該基因在第3外顯子存在l1個堿基(937～947)的缺失,造成移碼突變,使得從缺失后面的第14個密碼子開始停止翻譯,其結果是C-端僅7個氨基酸得到翻譯,其余102個氨基酸(274～375)全部缺失,翻譯出的是一個截斷蛋白而失去抑制肌肉生長的作用。雙肌表型的皮埃蒙特牛中MSTN基因也發(fā)生了2個突變,一個突變位點位(G※A)于第3外顯子,結果導致保守的半胱氨酸(Cys)被酪氨酸(Tyr)所取代,使得肌肉生長抑制素的功能全部或幾乎全部喪失。經Southern雜交分析表明,比利時蘭牛和皮埃蒙特牛均為突變純合子。另一個突變在第1外顯子上(C※A),結果導致亮氨酸(Leu)變?yōu)楸奖彼?Phe)。分析表明,未在皮埃蒙特牛中檢出突變,只在紅安格斯牛(Red Angus)中發(fā)現(xiàn)1例比利時蘭牛型突變的雜合子,說明該基因的突變是造成雙肌的原因之一[2,17]。從功能上看,雙肌牛中MSTN基因的突變導致該基因產物活性喪失,分子活性區(qū)域消失,結果肌肉大量增加,使飼料轉化效率提高。不利的效應是母牛的生育能力下降,犢牛的成活率降低以及性成熟延遲,還會使牛肉的肌間脂肪及結締組織減少,機體內部器官重量減輕等[18]。Bellinge[19]等在牛MSTN基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)9種能產生非同義密碼子的突變,其中3種為錯義突變,包括外顯子1中2種和外顯子2中1種。另外6種突變位于外顯子2和外顯子3,導致提前形成終止密碼子,致使蛋白失活,從而失去了對肌纖維生長發(fā)育的抑制作用。Grobet[20]等檢測了10個歐洲牛品種的32頭雙肌牛,發(fā)現(xiàn)了7個DNA多態(tài)型,其中5個推測造成了蛋白質功能的改變,1個為保守氨基酸替換,另一個為沉默DNA突變,在內含子中檢出了4個DNA多態(tài)型,除2個品種外,其它品種的雙肌牛均為5個功能缺失突變體之一的復雜雜合子或是純合子,缺少明顯功能突變的其它2個品種推測在基因的未測片段有另外的突變或是雙肌牛的位點異質性所致 。史明艷[21]等對南陽牛和秦川牛的MSTN基因全序列研究結果表明:45頭南陽牛種只有第三外顯子938位堿基處發(fā)生了G※A的突變,而30頭秦川牛中沒有突變。常春芳[22]等對4個品種66個樣本MSTN基因外顯子2序列分析結果表明:18個雷瓊牛樣本沒有發(fā)生變異,多態(tài)性較貧乏,18頭蒙古牛有1個變異位點,牦牛有2個變異位點,而12頭獨龍牛有1個位點發(fā)生變異。冀德君[23]等在18頭蒙古牛樣本中檢測到1個核苷酸多態(tài)位點,含有兩種核苷酸類型。在19頭海子水牛樣本中檢測到3個核苷酸多態(tài)位點以及2種基因單型。Li[24]等測定了24個山羊品種、8個綿羊品種MSTN基因部分內含子2序列,發(fā)現(xiàn)7個多態(tài)位點,屬于完全連鎖平衡,能劃分出3個單倍型。在綿羊品種中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點。Clop[25]等發(fā)現(xiàn)雙肌羊 Texel是由于MSTN基因3'UTR(Untranslated Regions,非翻譯區(qū))發(fā)生了1個點突變,產生miR1和miR206兩種骨骼肌表達的microRNAs,抑制MSTN基因的翻譯,從而導致Texel肌肉肥大的性狀。

4.3 MSTN基因的基因敲除研究

采用基因打靶技術人工剔除MSTN基因,獲得轉基因動物的研究已取得較大進展,如剔除MSTN基因的小鼠。目前以體細胞MSTN基因敲除生產轉基因牛、羊的研究工作都正在進行中。2011年孫丹[26]等利用LA-PCR技術,對分子克隆連接技術進行優(yōu)化,最大可能獲取長片段基因序列作為同源臂,應用基因打靶技術體外構建針對綿羊MSTN基因第3外顯子的基因打靶載體,使綿羊體內MSTN基因失活,以達到提高產肉量的目的。李湘萍[27]等對綿羊體細胞MSTN基因進行敲除實驗,結果表明對綿羊成纖維細胞進行基因修飾是可行的。

5 MSTN基因的應用前景

MSTN基因是繼生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGFs)之后新發(fā)現(xiàn)的功能基因,由于該基因是骨骼肌生長抑制因子,通過對該基因的研究,基因突變是引起雙肌性狀的重要原因之一已經很明確了,這就為增加動物機體產肉量提供了一種方式和途徑,為動物育種學家提供了一種新思路。于是國內外學者試圖通過基因敲除和轉基因等方法達到增加肉產量和提高肉品質的目的,若能利用基因敲除技術能在?；蜓虻戎匾馊菁倚笊锨贸齅STN基因而產生骨骼肌明顯增大的品質,這將具有很高的經濟價值。另外也可以在畜牧業(yè)上可以篩選MSTN基因突變的個體,通過育種培育出產肉率高的優(yōu)良品種。此外,利用基因重組技術可以獲得MSTN基因缺失的動物,或通過篩選MSTN基因的抗體或抑制劑,使之與MSTN基因結合,滅活其功能,從而進一步開發(fā)安全可靠的新型飼料添加劑,為生產放心肉提供新的途徑。

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