劉海燦 萬康林

目前,隨著結(jié)核分枝桿菌 (M ycobacterium tuberculosis,M.tubercu losis)H 37Rv、CDC1551、H 37Ra、F11和KZN 1435等菌株全基因組測序工作的完成,以及新一代核酸測序技術(shù)的飛速發(fā)展,使得結(jié)核分枝桿菌研究進入新階段,即可以從基因組水平對其進行更深入的研究[1～3]。近年來,有許多從基因水平研究結(jié)核分枝桿的菌種鑒定、菌株分型、分子進化以及藥物敏感性檢測等的文獻報道[4～10]。本文將就結(jié)核分枝桿菌基因組單核苷酸多態(tài)性 (single nuc leotide po lymorphism s,SNP)的鑒定、檢測方法及其應(yīng)用研究進行綜述。

SNP主要是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的基因組DNA序列多態(tài)性,這種多態(tài)性包括單個堿基的轉(zhuǎn)換 (transition)、顛換 (transversion)、插入(insertion)和缺失 (deletion)等 4種形式,但研究中通常認為 SNP僅包括轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。SNP可位于基因組的基因編碼區(qū)、非基因編碼區(qū)和基因間隔區(qū),如果 SNP發(fā)生在基因編碼區(qū),但未造成基因編碼的氨基酸序列改變,稱為同義 (synonymous)SNP,若造成基因編碼的氨基酸序列改變或肽鏈被提前終止,則稱為非同義(non-synonymous)SNP。

一、結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的鑒定方法

結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP有多種鑒定方法,但依據(jù)其基本原理可分為兩大類:一類是DNA測序相關(guān)方法,主要有全基因組測序和目的基因片段測序兩種;另一類是基于 PCR擴增的非DNA測序方法,如實時定量 PCR(real-tim e PCR,RT-PCR)、PCR限制性片段長度多態(tài) (PCR-RLFP)、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探針)檢測等。

1.基于DNA測序分析的 SNP鑒定方法:(1)全基因基組測序分析:隨著核酸測序技術(shù)的飛速發(fā)展,全基因組測序所需時間和經(jīng)濟成本不斷降低,完成全基因組測序的微生物菌株越來越多,使得我們能夠從全基因組水平研究和分析不同菌株間的差異以及其生物學意義。例如:Fleischm ann等[1]完成了結(jié)核分枝桿菌 CDC1551株的全基因組測序工作,并結(jié)合已經(jīng)發(fā)布的 H 37Rv株序列數(shù)據(jù)進行了比對分析。通過分析發(fā)現(xiàn)了多個基因的 SNP,另外發(fā)現(xiàn)包括 PE/PPE基因家族 (PE/PPE gene fam ily)在內(nèi)的一些基因家族,在全基因組水平有較高水平的同義和非同義 SNP的發(fā)生。(2)目的基因 DNA片段測序分析:雖然全基因組序列比對分析可以更全面地發(fā)現(xiàn)不同菌株間的 SNP,但是受到完成全基因組測序的菌株數(shù)量和費用等條件限制,于是人們研究建立了更經(jīng)濟、高效的目的基因DNA片段測序分析方法,并廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP鑒定研究。例如:Baker等[11]用 PCR擴增了結(jié)核分枝桿菌 7個管家基因片段 (rpo B、ka t G、oxy R,ahp C,pnc A,rps L,和 gyr A),經(jīng)純化、回收后用AB Ip rism 3700測序儀進行測序,研究這些基因 DNA序列中的 SNP。Talarico等[12]用PCR對 200株臨床菌株的 PE_PGRS16和 PE_ PGRS26基因進行擴增并測序,再與 H37Rv序列進行比對分析,發(fā)現(xiàn)了兩個基因序列中的 SNP以及其他DNA序列多態(tài)性。

2.其他非DNA測序的 SNP鑒定方法:非測序相關(guān)的鑒定方法,主要是與 PCR相結(jié)合進行特異性位點的 SNP檢測,通常已確認某位置存在 SNP,用來檢測該 SNP在檢測樣本或者群體中的分布情況。常用的方法主要有:(1)RT-PCR:RT-PCR方法是常用的 SNP驗證方法,特點是快速、簡便,但不同研究中建立的 RT-PCR方法稍有差異。例如:Ereqat等[13]用 RT-PCR結(jié)合高分辨率熔解試驗的方法,檢測nar GHJI和 oxy R基因中的 SNP及第 1個差異區(qū) (region of difference 1,RD 1),快速鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌 (M ycobacterium bovis,M.bovis)。而 Hazbon等[14]采用了發(fā)夾狀引物 (hairp in p rim ers)來進行RT-PCR實驗,通過比較引物與模板互補的反應(yīng)和引物與模板不互補的反應(yīng)的 RT-PCR循環(huán)閾值的差異 (ΔCt),分析不同菌株中的 SNP存在情況。(2)PCR-RFLP:如果 SNP發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上會導致酶切位點的增加或消失,利用這一酶切性質(zhì)的改變,將特異的 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后,用瓊脂糖凝膠電泳分離,再與正常 PCR產(chǎn)物酶切圖譜進行比對分析即可確認 SNP的存在情況。例如:Gibson等[15]用 PCR-RFLP方法檢測Ag85C(Rv0129c)基因第 103位密碼子的 1個 SNP (GAG-GAA),PCR目的片段的大小為 519bp,用M n lI限制性內(nèi)切酶切割,再用 4%瓊脂糖凝膠進行分離。如果該 SNP存在,僅會有 461bp和 58bp兩個條帶;若不存在則會是 365、96和 58bp 3個條帶 (電泳圖上看不到 58bp條帶),從而確定該基因中的 SNP存在情況。(3)PCR-SSCP:SSCP測定中雙鏈 DNA被變性成為單鏈DNA,每條單鏈DNA都基于其內(nèi)部序列不同而呈現(xiàn)出獨有的折疊構(gòu)象,這些單鏈DNA在非變性條件下用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,由于折疊構(gòu)象和電泳時溫度的不同而呈現(xiàn)出不同的遷移率和帶型,最后依據(jù)電泳圖譜類型確認樣品中的 SNP情況。例如:Torres等[16]用 PCR-SSCP方法檢測了兩個利福平和 1個異煙肼耐藥相關(guān)基因(rpo B、ka t G和 ahp C)的 DNA序列變異情況,確認了檢測樣品中 3個基因的 SNP發(fā)生情況。(4)基因芯片和基因探針法:由于基因芯片可進行高通量 (high -throughput)的實驗操作和分析,近年來也被用于結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的驗證和分析。例如:Deng和 Xu等[17,18]在研究中采用了不同的芯片檢測方法,研究利福平耐藥相關(guān)基因 rpo B中的 SNP情況。他們發(fā)現(xiàn)芯片法和DNA測序確定的 rpo B基因中的 SNP情況具有較高的一致性,可用來檢測大量樣品 rpo B基因的 SNP情況。(5)其他 PCR方法:除了上述方法外,還有一些特異性的以 PCR為基礎(chǔ)的 SNP鑒定方法。例如:A lix等[19]在鑒定 Haarlem基因型特異的SNP標志時,建立了一種“On/O ff sw ich assay”方法,針對測序分析發(fā)現(xiàn)的 m g t C基因 SNP,設(shè)計了特異性的 PCR擴增引物,依據(jù)不同引物能否擴增出目的基因片段,驗證基因序列中的 SNP情況。M arm e等[20]應(yīng)用熒光光譜分析方法,可快速檢測 PCR產(chǎn)物中目的片段的 SNP情況。

二、結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的應(yīng)用

上述各種鑒定方法確認的結(jié)核分枝桿菌基因組SNP,被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、菌株分型、藥物敏感性檢測,以及進化分析和流行病學監(jiān)測等多個方面。

1.藥物敏感性檢測:目前的研究認為,結(jié)核分枝桿菌耐藥性的發(fā)生由多個基因突變導致,耐藥性相關(guān)基因的 SNP檢測成為結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測的重要方法[16,21～24]。如:異煙肼耐藥相關(guān) SNP主要發(fā)生在:ka t G、ahp C、inh A、kas A和 ndh等基因中, ka t G315密碼子 SNP在異煙肼耐藥株有 30%～60%發(fā)生率,而 rpo B526和 rpo B531密碼子的 SNP與結(jié)核分枝桿菌高水平的利福平耐藥相關(guān)[25]。近年來,隨著結(jié)核分枝桿菌二線藥的應(yīng)用和耐藥菌株的出現(xiàn),二線藥耐藥相關(guān)基因的 SNP研究也多有報道[26]。這些耐藥性相關(guān) SNP的發(fā)現(xiàn)和其檢測方法的建立,為結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的快速鑒定奠定了基礎(chǔ),也將為臨床上針對耐藥性結(jié)核的藥物治療提供支持。

2.菌種快速鑒定:結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌等均可引起人類感染并導致結(jié)核病癥狀,而不同菌種感染臨床上有不同的治療措施,因此,患者感染菌株的快速菌種鑒定也是臨床上采取針對性治療的迫切需要。Chauhan等[5]研究發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌和卡介苗(bacillusCalm ette-Guérin,BCG)nar K2X基因啟動子區(qū)域有 1個 SNP突變,這個 SNP的存在造成兩者與結(jié)核分枝桿菌在缺氧環(huán)境中誘導表達硝酸/亞硝酸還原酶能力的差異。通過檢測這個 SNP可快速、準確的把結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 (M.tubercu losis comp lex,M TC)其他成員,包括牛分枝桿菌、卡介苗、非洲分枝桿菌(M.africanum)和田鼠分枝桿菌(M.m icroti)區(qū)分開。

3.分子分型:(1)結(jié)核分枝桿菌北京家族(Beijing fam ily)特異的 SNP標志:結(jié)核分枝桿菌北京家族(M. tubercu losis Beijing fam ily)或稱結(jié)核分枝桿菌北京基因型 (M.tubercu losis Beijing geno type)被認為具有更高的毒力和傳播能力,有明確的機制證明其與某些藥物耐藥相關(guān),并被報道與多起結(jié)核病暴發(fā)相關(guān),是一個被密切監(jiān)測的譜系 (lineages),因此,需要建立北京家族快速、準確的鑒定方法。Homo lka等[7]研究認為Rv2629等位基因中的 A 191C突變是北京基因型的生物學標志,A lonso等利用該 SNP標志建立了一種與 RT-PCR結(jié)合的高分辨率熔解 (high-resolution m elting)實驗,可快速區(qū)分北京家族與非北京家族的菌株。(2)結(jié)核分枝桿菌其他基因型相關(guān)的 SNP標志:除了北京型特異的 SNP標志,也有文獻報道其他基因型相關(guān)的特異幾天 SNP標志。例如,Chuang等[6]的研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)核分枝桿菌 fad D28基因 507位密碼子存在ATC到ATT的突變,該 SNP的存在可作為結(jié)核分枝桿菌東亞群 (east asia lineage)的特異性標志。A lix等[19]通過對具有代表性的臨床菌株的研究發(fā)現(xiàn),m g t C基因中的一個 SNP(A 182C)與 Haarlem基因型相關(guān)。

4.進化分析和流行病學研究:(1)進化分析:許多研究認為結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP可被用來進行進化分析,特別是其中的同義 SNP,由于研究認為其不受選擇壓力的影響,被認為是進行結(jié)核分枝桿菌進化分析的理想生物學標。例如:Sreevatsan等[27]通過DNA測序和與 PCR相結(jié)合的酶切分析,依據(jù) ka t G463和 gyt A95兩個非同義 SNP突變,成功將屬于M TC的菌株劃分為 3個基因群 (Group 1/2/3),其中第 1群進化上相對古老,可能與牛分枝桿菌來自同一進化祖先。Fillio l等[28]用 212個 SNP標記對來源于全球的323株樣品進了檢測,并依據(jù) SNP標志的發(fā)生情況進行聚類分析,將結(jié)核分枝桿菌分為 6個主要的 SNP聚集群(SNP c luster groups,SCGs)和 5個亞群 (subgroup)。兩者研究結(jié)果具有很好的一致性,所有的Group 1菌株都分布在 SCG-1、SCG-3a和 SCG-2 3個群中,所有的 Group 2菌株都分布在 SCG-3b/c、SCG-4和 SCG-5群中,所有的 Group 3菌株都為SCG-6a/b群的菌株。(2)流行病學研究:結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP,也可用來對從同一個感染鏈條、不同患者體內(nèi)分離的菌株進行進化分析,進而對整個感染鏈條進行清楚的流行病學分析。如 Schurch等[29]對處于一個確認的結(jié)核分枝桿菌傳播和感染鏈條中的患者體內(nèi)分離的菌株,通過DNA測序分析及其他鑒定方法,確認了包括4個 SNP在內(nèi)的6個多態(tài)性位點。Schurch等研究認為這種患者間的菌株進化速度和進化模式分析表明,結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的分子進化是由短時的變異暴發(fā) (burstsofm utation)和相對較高的基因組穩(wěn)定性共同決定的,這種進化與變異機制,為抗結(jié)核疫苗和藥物的開發(fā)、應(yīng)用,以及結(jié)核分枝桿菌感染暴發(fā)的管理提供了重要依據(jù)。

三、結(jié)核分枝桿菌基因 SNP研究展望

目前,臨床上相當數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌感染者,由于受結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)的時間、技術(shù)和實驗室硬件等要求的限制,其感染的菌株并沒有得到及時的分型鑒定和藥物敏感性檢測,僅能給予經(jīng)驗性的治療措施,不利于結(jié)核病 (特別是耐藥性結(jié)核)的治療和控制。但綜上可知,上述 SNP檢測方法的建立和廣泛應(yīng)用,為快速、高效地進行臨床標本的菌型鑒定和耐藥性檢測創(chuàng)造了條件,也給臨床上實施針對性的治療方案提供支持。同時,由于其在進化分析方面的廣泛應(yīng)用,也為結(jié)核分枝桿菌的進化研究和流行病學監(jiān)測提供了有力支持,通過對結(jié)核分枝桿菌基因進化的研究和分析,可以更深入了解不同菌株間毒力差異的機制,為疫苗和抗結(jié)核藥物的開發(fā)提供理論依據(jù);而作為流行病學監(jiān)測手段,可以為我們提供明確的傳播和感染模型,為結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防、控制策略的制訂和實施提供理論和技術(shù)支持。

結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP研究的不斷深入和應(yīng)用的日益廣泛,為我們更深入地進行結(jié)核分枝桿菌相關(guān)研究提供了新的研究方法和研究方向,也為臨床結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷和治療提供了便利,將會促進我們對結(jié)核分枝桿菌進化、致病機制、流行與傳播特征以及感染后免疫和耐藥發(fā)生機制的認識,并將為最終實現(xiàn)結(jié)核病預(yù)防和控制目標提供幫助。

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