朱金輝，萬麗麗，郭澄（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海市200233）

對稱性二甲基精氨酸（Symmetric dimethylarginine，SDMA）和非對稱性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一對同分異構(gòu)體，主要來自于體內(nèi)甲基化蛋白的水解，兩者在體內(nèi)發(fā)揮不同的生理調(diào)節(jié)作用。ADMA是一種內(nèi)源性的一氧化氮合酶（NOS）抑制劑，可與精氨酸競爭性結(jié)合NOS活性部位，對調(diào)節(jié)一氧化氮合成和內(nèi)皮功能起著非常重要的作用[1]。大量的臨床研究證實(shí)，伴有內(nèi)皮功能不全的心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、充血性心力衰竭和糖尿病等患者的血中ADMA水平均有顯著增加，且ADMA水平的升高與心血管事件的發(fā)生率和病死率呈明顯正相關(guān)[2]。而SDMA雖然對NOS沒有作用，但是能夠反映腎功能的變化，是腎小球?yàn)V過率變化的一個(gè)早期標(biāo)志物[3]。因此，無論從試驗(yàn)角度還是臨床需求，都需要建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確測定血液中ADMA和SDMA的方法。由于ADMA和SDMA的化學(xué)性質(zhì)十分接近，以往的文獻(xiàn)報(bào)道，在樣品處理時(shí)大多采用加入衍生化試劑對兩者進(jìn)行色譜分離以后再測定，步驟煩瑣、費(fèi)時(shí)[4]。近幾年，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，有研究表明[5]，可利用ADMA和SAMA各自的特征碎片離子峰同時(shí)檢測其濃度，免去了色譜分離的步驟，簡化了樣品處理過程，適用于臨床大規(guī)模樣本的檢測。本研究在此基礎(chǔ)上對方法作了進(jìn)一步的優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent QQQ液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括G1311A型四元輸液泵、G1322A型脫氣機(jī)、G1367B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G6410B型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、電噴霧源和Mass-Hunter工作站（美國Agilent公司）；Millipore Simplicity 185型超純水系統(tǒng)（法國Millipore公司）；Vortex Genie 2型渦旋混懸器（美國Vortex公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（中國湘儀公司）。

1.2 試藥

SDMA對照品（批號：D00085051，純度：＞98.0%）、ADMA對照品（批號：D00069835，純度：＞98.0%）均采購自美國Sigma公司；內(nèi)標(biāo)：氫溴酸右美沙芬對照品（批號：100201-200502，純度：94.9%）購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲酸、甲酸銨為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Thermo Hypercarb柱（50 mm×4.6 mm，5 μm）；Zorbax SB-C8保護(hù)柱（2.1 mm×12.5 mm）；流動(dòng)相：乙腈∶甲酸銨-甲酸緩沖溶液（5 mmol·L－1甲酸銨，0.1%甲酸）（梯度洗脫程序見表1）；流速：0.40 mL·min－1；分析時(shí)間：8 min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution process of mobile phase

電噴霧電離源（ESI源），霧化氣（N2）壓力：35 psi；干燥氣（N2）流速：10 mL·min－1；干燥氣溫度：350 ℃；正離子方式檢測；毛細(xì)管電壓：3 500 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。MRM檢測參數(shù)見表2。ADMA、SDMA的二級質(zhì)譜見圖1。

表2 MRM檢測參數(shù)Tab2 MRM parameters for the detection

圖1 二級質(zhì)譜圖A.ADMA；B.SDMAFig1 MS2 spectrumA.ADMA；B.SDMA

2.2 溶液的配制

2.2.1 SDMA貯備液：準(zhǔn)確稱取SDMA對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg·mL－1的SDMA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 ADMA貯備液：準(zhǔn)確稱取ADMA對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg·mL－1的ADMA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 工作溶液：取SDMA和ADMA貯備液適量，以水稀釋，制備成相當(dāng)于濃度為0.5、1、2、2.5、5、10 mg·mL－1的系列混標(biāo)溶液。

2.2.4 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取氫溴酸右美沙芬對照品適量，以乙腈溶解，配制成濃度為50 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取待測血漿100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含內(nèi)標(biāo)右美沙芬50 ng·mL－1的乙腈溶液，渦旋30 s，13 000 r·min－1離心6 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿100 μL，加混標(biāo)溶液5 μL，制成相當(dāng)于SDMA和ADMA濃度均為25、50、100、125、250、500 ng·mL－1的模擬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物的濃度（X）為橫坐標(biāo)，對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，同時(shí)將5份空白血漿中的峰面積比值取均值，作為背景扣除后，進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得線性回歸方程分別是：YSDMA＝0.005 2XSDMA+0.038 8（r＝0.999 8）、YADMA＝0.005 8XADMA+0.063 5（r＝0.995 3）。結(jié)果表明，SDMA和ADMA血藥濃度均在25～500 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的定量下限均為25 ng·mL－1，RSD分別為6.36%和5.70%。

2.5 準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)

取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的混標(biāo)溶液5 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，并隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，分別求算方法回收率和日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表3。

表3 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3Results of recovery and precision tests（n＝6）

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

取空白血漿100 μL，除使用不含內(nèi)標(biāo)的乙腈沉淀蛋白外，其他按“2.3”項(xiàng)下方法操作后，用獲得的上清液中加入低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控樣品和內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣獲得峰面積；同樣以水代替空白血漿進(jìn)行相同處理，獲得峰面積。比較2種處理方式下，用3種化合物的峰面積之比評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。SDMA和ADMA比值在105%～120%，內(nèi)標(biāo)的比值在90%～95%。結(jié)果表明，本方法不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.7 穩(wěn)定性考察

取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的混標(biāo)溶液5 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和測定，分別考察SDMA和ADMA血漿樣品（未處理）室溫放置4 h，4℃放置24、48 h，處理后室溫放置24 h，3周期凍融試驗(yàn)和－20℃冷凍放置1、2、4周的穩(wěn)定性。結(jié)果，未處理的樣品在以上保存條件下測得的相對誤差（RE）均在±10%之內(nèi)，RSD均＜15%；處理后24 h內(nèi)RE在±4.62%之內(nèi)，RSD＜4.8%，表明血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

3 討論

在對SDMA和ADMA進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者在色譜柱上的保留行為十分相似，出峰時(shí)間一致。二者且擁有幾乎相同的碎片離子峰，但其中有2個(gè)碎片離子峰卻是各自所特有的：m/z203.1→172.1（SDMA）與m/z203.1→46.1（ADMA）。對20 ng·mL－1對照品進(jìn)樣的結(jié)果顯示，信噪比分別是69和58，可用于定量分析。ADMA和SDMA的碎片離子峰見表4。

本方法所用的色譜柱為Thermo公司的Hypercarb柱，填料為石墨炭（Graphitic carbon），對比Agilent的C18柱和苯基柱，Hypercarb柱對SDMA和ADMA的響應(yīng)更好，以20 ng·mL－1對照品為例，其響應(yīng)值是苯基柱的10倍。保留時(shí)間C18柱在0.5min就出峰，易受血漿中其他物質(zhì)的干擾；Hypercarb柱的保留時(shí)間在1.9 min，特異性較高，受基質(zhì)效應(yīng)影響小。

表4 ADMA和SDMA的碎片離子峰Tab4 Fragment ion peak ofADMAand SDMA

對于內(nèi)標(biāo)的選擇，國外文獻(xiàn)通常采用同位素內(nèi)標(biāo)，能夠直觀地解決穩(wěn)定性、特異性等問題，但價(jià)格比較昂貴，用于常規(guī)檢測顯然成本過高。而SDMA、ADMA的同系物幾乎都是內(nèi)源性的物質(zhì)，也不可采用。因此，筆者在內(nèi)標(biāo)的選擇上花費(fèi)了一定時(shí)間，最后選擇的右美沙芬符合內(nèi)標(biāo)的要求，對SDMA和ADMA的檢測無干擾。

ADMA作為一個(gè)NOS的內(nèi)源性抑制劑，在近幾年得到了越來越多的關(guān)注，相當(dāng)數(shù)量的臨床研究證實(shí)了ADMA在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中所扮演的重要角色[6]。對于ADMA如何應(yīng)用于疾病的預(yù)防及藥物對其的干預(yù)作用，目前尚處在研究中，但是一個(gè)快速、準(zhǔn)確的血漿濃度測定方法無論對于臨床研究還是科研探索都是必要的手段。

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