魏 巍，王希彪，黃宣凱，張 野，蘭曉明，劉建明，暴 國

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

1991年Fujii發(fā)現(xiàn)豬應(yīng)激綜合癥（Porcine stress syndrome,PSS）是蘭尼定受體基因（Ryanodine recetor gene RYR1）突變所致[1]，此突變是隱性突變，并認(rèn)為此突變基因即為氟烷隱性基因（Haln）。PSS易導(dǎo)致豬應(yīng)激而突然死亡或產(chǎn)生PSE肉[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，美國每年約損失2.3～3.2億美元[2]。研究表明Haln基因?qū)ωi的胴體性狀呈加性效應(yīng)[3]，可使豬胴體重增加2%～3%，但又會減少窩產(chǎn)仔數(shù)和增加PSE肉的發(fā)生率[4-5]。

我國地方豬種攜帶Haln基因較少，李來記報道的二花臉豬Haln基因的頻率為0.57%、民豬Haln基因的頻率為15.62%、五指山和香豬Haln基因的頻率為0；陳蘊穎等報導(dǎo)的內(nèi)江豬、版納豬和五指山小耳豬Haln基因的頻率也為0；方美英報道的姜曲海豬、內(nèi)江豬、桃園豬和香豬Haln基因的頻率為0，民豬Haln基因的頻率為10%[6-8]。近年來對中國地方豬種Haln基因的研究，越來越多的采用測序的方法，如趙中權(quán)等分析了藏豬Haln基因序列及其多態(tài)性[9]；李來記等對二花臉、香豬MHS基因的DNA序列進行了比較[10]；帥素容等分析了內(nèi)江豬、太湖豬、成華豬和雅南豬Haln基因序列并與國外豬種做了對比分析[11]，而民豬在此方面的研究一直未見報道。民豬具有抗逆性強、肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)優(yōu)良、高繁殖力等優(yōu)點，其優(yōu)良特性引起海內(nèi)外的重視[12]，在世界地方豬種排行榜中名列第四位[13]，2000年將其列入國家畜禽品種保護名錄[14]。因此本文對Haln基因在民豬群體中的分布進行了檢測并測定了民豬Haln基因的序列，為合理利用Haln基因和民豬選種選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自黑龍江省蘭西縣民豬保種基地，共48頭民豬個體。另外還查找了國內(nèi)外不同品種豬Haln基因的相同區(qū)段，序列來源與編號見表1。

表1 試驗樣品或序列來源Table 1 Source of experimental samples or sequences

1.2 方法

1.2.1 取樣

用耳號鉗采集少量耳組織，裝入盛有75%酒精的離心管中，帶回實驗室-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取

1.2.2.1 配制裂解液

試驗用裂解液為本實驗室改良的配方，100 mL豬耳組裂解液的配制方法如下：1 mol·L-1Tris-Cl（pH 8.0）5 mL，0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）20 mL，2 mol·L-1NaCl 5 mL，10%SDS 10 mL，1%Pr-k 1 mL。

1.2.2.2 基因組DNA的提取

蒸餾水清洗耳組織并剪碎→55℃過夜消化耳組織→加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入等體積的酚：氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入等體積的氯仿∶異戊醇=24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置30 min→4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清→加入2倍體積的預(yù)冷的75%乙醇，4℃，12 500 r·min-1離心5 min；棄上清→晾干后，加入100 mL 0.1×TE，55℃溶解DNA→-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 基因組DNA的檢測

用1.0%Agarose凝膠電泳檢測DNA的完整性，用紫外分光光度計測定其在OD260和OD280的光度值，通過OD260/OD280計算原液的純度，通過OD260×稀 釋 倍 數(shù) ×50（ng·mL-1）計 算 原 液 濃度，-20℃保存DNA原液。

表2 引物序列、退火溫度及目的片段大小Table 2 Sequences,annealing temperature and size of motive frag

1.2.3 Haln基因的PCR擴增

引物序列采用Fujii等的研究成果[1]，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體信息見表2。

PCR擴增反應(yīng)液（25 μL）組成如下：基因組DNA（100 ng·μL-1）2 μL，dNTP（2.5 mmol·mL-1） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Haln-613-F（10 pmol·mL-1）1 μL，Haln-613-R（10 pmol·mL-1）1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.4 μL，加水補足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min，30×(95℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物于1.2%Agarose凝膠電泳，切取600 bp左右處的片段，回收純化目的DNA，送至上海生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 酶切

采用Hha Ι內(nèi)切酶對擴增的Haln基因613 bp片段進行酶切，酶切反應(yīng)體系組成如下：Hha Ι（10 U·μL-1）限制性內(nèi)切酶 0.35 μL，10×buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，ddH2O補足至10 μL。酶切反應(yīng)條件：37℃水浴4 h[16]。酶切產(chǎn)物用1.2%Agarose凝膠電泳，GoldView（GD）染色、凝膠成像儀成像拍照分析。

1.3 統(tǒng)計分析

用BioEdit等軟件分析所測樣本的序列，并與其他10個品種（系）的Haln基因相比尋找突變位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

從豬耳組中提取的基因組DNA濃度約為2 735 ng·μL-1，其純度在1.7～1.9范圍之內(nèi)，1%Agarose凝膠電泳圖譜中觀察，是一條光滑整齊的條帶（見圖1）。

圖1 DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of DNA

2.2 Haln-PCR擴增結(jié)果

經(jīng)PCR特異性擴增的目的片段全長為613 bp，由電泳圖譜可見無雜帶（見圖2）。

2.3 Haln-Hha I酶切結(jié)果

結(jié)果見圖3。

PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hha Ι消化獲得的Haln基因座位3種基因型的特征帶型為：HalNHalN（NN）為500 bp和113 bp 2條帶；HalNHaln（Nn）613 bp、500 bp和113 bp 3條帶；HalnHaln（nn）只有1條613 bp帶（見圖3和表3）。

圖2 Haln基因PCR擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of halothane gene

圖3 民豬Haln基因PCR產(chǎn)物Hha I酶切電泳Fig.3 Electrophoersis pattern of Hha I-RFLP of halothane gene's PCR products in Min pig

表3 民豬群體的Haln基因座位的基因型頻率和基因頻率Table 3 Genotypic frequency and gene frequency in halothane gene of Min pigs

2.4 PCR產(chǎn)物序列分析

對HalNN型民豬、太湖豬、內(nèi)江豬、成華豬、雅南豬、長白豬、二花臉、香豬、藏豬、長白豬和皮特蘭豬的含C1843在內(nèi)的614 bp Haln基因片段進行了序列分析與品種（系）間的比較，民豬Haln基因序列如下（見圖4和表4）。

圖4 民豬Haln基因PCR產(chǎn)物序列Fig.4 Sequence of PCR products of halothane gene in Min pig

表4 11個品種豬Haln基因部分片段DNA序列變異位點Table 4 Mutation sites in Halngene amino acid sequence of 11 varieties pigs

3 討論

自Fujii等確定了豬Haln基因的核苷酸序列和突變位點以來[1]，PCR-RFLP技術(shù)檢測Haln基因型變得日趨完善[17]，有的國家已建立了豬Haln基因的DNA檢測方法[18-20]，并在大范圍內(nèi)對豬育種群體進行了Haln座位的基因型分析[18]，對有效控制豬群的Haln基因頻率起到了重要的作用[20]。雖然我國Haln基因DNA檢測技術(shù)和分子生物學(xué)分析剛剛起步，但隨著國外優(yōu)良品種的引入和我國豬遺傳改良的進一步深入，以及瘦肉品種、品系的培育，Haln基因的研究將引起重視，并將得到應(yīng)用和發(fā)展。

3.1 不同品種豬Haln基因座位的基因頻率

本研究中民豬的Haln基因頻率與國內(nèi)報道有一定的差異，比方美英（10%）[8]、李來記（15.62%）[10]報道的Haln基因頻率稍大，這可能是由于隨機抽樣，隱性Haln基因的樣本過于集中，使試驗數(shù)據(jù)較高；或者是由于該樣本處于保種群體中，長期的近交使得Haln基因頻率增加。Fujii等證明了長白、杜洛克、皮特蘭等品種的Haln基因具有同一起源[1]，而關(guān)于民豬Haln基因的起源還未被證實，有待進一步研究。

3.2 不同品種Haln基因序列的種間差異

Fujii等通過對皮特蘭豬和約克夏豬的HalncDNA全序列比較[1]，發(fā)現(xiàn)18個單堿基的差異。本文通過對不同品種（系）Haln基因序列比較分析，發(fā)現(xiàn)不同品種（系）間Haln612序列存在差異：皮特蘭豬C1843→T1843；皮特蘭A1437→G1437；二花臉和皮特蘭C1544→T1544；皮特蘭 T1555→C1555；皮特蘭 C1582→T1582；長白-Brenig、藏豬和長白C1585→T1585，太湖豬、內(nèi)江豬、成華豬長白-Brenig和二花臉A1588→G1588；成華豬 T1626→C1626；皮特蘭 C1674→G1674；皮特蘭 C1751→T1751；皮特蘭 C1800→T1800；皮特蘭 C1844→T1844；內(nèi)江豬C1888→T1888；二花臉和皮特蘭G1981→A1981。在所比較的11個豬品種（系）間Haln基因的DNA序列差異均為單核苷酸的替換，未發(fā)現(xiàn)多堿基和大片段的插入、缺失和移框突變。除Fujii等確定的C1843→T1843的突變造成氨基酸替代（Arg615→Cys615）與豬PSS有關(guān)外，其他的引起氨基酸改變的堿基突變與豬PSS的關(guān)系還有待證實[1]。而本研究中所發(fā)現(xiàn)的品種間13個突變大部分可能屬于品種特異性改變，與豬PSS的發(fā)生是否有關(guān)還有待進一步分析。

4 結(jié)論

本試驗通過PCR-RFLP方法檢測了民豬群體中Haln基因的基因型頻率和基因頻率，結(jié)果表明民豬在長期的保種過程中HalnHaln型基因頻率有所增加，n基因頻率稍有升高。在比較民豬與其他品種豬Haln基因序列的區(qū)別時，發(fā)現(xiàn)皮特蘭與民豬的差異最大，內(nèi)江豬與民豬的差別最小。這個結(jié)果可以很有效的說明皮特蘭豬肉質(zhì)較差，而民豬肉質(zhì)較好的原因。在實際生產(chǎn)中Haln基因給豬肉生產(chǎn)者和豬肉加工者帶來了巨大的損失，因此，通過遺傳育種選育抗應(yīng)激的豬種具有實際意義。

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