張冬杰，劉 娣，汪亮，王文濤，楊國偉

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086）

葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（Glucose－6－phosphate dehydrogenase，G6PDH）與6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6－phosphaogluconate dehydro－genase， 6PGDH）是植物戊糖磷酸途徑中的兩個關(guān)鍵酶。G6PDH的胞質(zhì)基因與動物和真菌等真核生物具有共同的祖先；6PGDH的胞質(zhì)酶和質(zhì)體酶基因都起源于原核生物的內(nèi)共生[1]。在甜楊上的研究結(jié)果表明，低溫下G6PDH的活性會顯著的提高[2]。在人醫(yī)上主要是研究該酶在紅細(xì)胞內(nèi)活性降低和（或）酶性質(zhì)改變而導(dǎo)致的溶血性疾病。豬的PGD基因（6－phosphogluconate dehydrogenase）最初是從肝臟組織的cDNA文庫分離獲得的，并通過原位雜交的方法定位在6q2.5－2.7[3]，而后的研究認(rèn)為它與肌肉的硬度也存在一定的相關(guān)性[4]。

乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）是動物體內(nèi)參與糖酵解的重要酶類，能催化丙酮酸與乳酸的相互轉(zhuǎn)變。LDH為四聚體，由M、H兩個亞基組成（分別由A和B基因編碼），共有5種同工酶形式LDH1～LDH5[5]。目前有關(guān)LDH的研究已較多，涉及到基因定位和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)調(diào)控等方面[6－8]。在分子進(jìn)化方面，Holland等初步研究了LDH對溫度的適應(yīng)性[9]；Glenn和Peter等通過對幾種不同的冷水魚在不同溫度下LDHA的氨基酸序列以及酶動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[10－11]，抗冷與不抗冷品種之間，在氨基酸序列上僅存在1～4個點(diǎn)突變，但這些點(diǎn)突變位于活性區(qū)域內(nèi)，通過精細(xì)的構(gòu)象改變，改變蛋白質(zhì)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，影響蛋白質(zhì)的靜電分布或構(gòu)象彈性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。在綜合分析了PGD和LDHA基因已有的生物學(xué)功能研究報道，本研究將其作為可能影響民豬抗寒特性的候選基因進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

75日齡民豬3窩共計12頭，將每窩個體隨機(jī)分成2組即常溫組和低溫組，每組各6頭，均購自黑龍江省農(nóng)科院畜牧研究所。2009年12月25日到2010年1月6日期間，將常溫組置于正常舍內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在10℃左右，低溫組在舍外半敞式大棚內(nèi)飼養(yǎng)，平均溫度為－20℃，兩組均飼喂相同的飼料。處理結(jié)束后，屠宰，取大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟各10 g左右，液氮帶回實(shí)驗(yàn)室，－80℃冰箱凍存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按照TRIZOL試劑的操作手冊進(jìn)行大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的RNA提取，獲得RNA后，進(jìn)行質(zhì)量和濃度的測定，隨后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，合成后－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上已公布的豬的PGD基因（X16638）、LDHA基因（AK236433）和β－actin基因（AK240355）序列設(shè)計引物，引物序列如下：PGDF： 5'GTGTTCCTGGGCAAGATAAA 3'， PGDR：5'AGAAGGAGAGGGCAGTGGT 3'；LDHAF：5'TGT GGCTTGGAAGATAAG 3'， LDHAR： 5'GAGACAC CAGCAACATTTA 3'； actinF： 5'CGGGACCTGACC GACTACCT 3'，actinR：5'GGGCCGTGATCTCCTTC T G 3'。送交上海生工合成。

1.2.3 Real－time PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：上、下游引物各0.8 μL，Mix 10 μL，模板0.8 μL，H2O 7.6 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序如下：95℃10 min，95℃30 s，60℃1 min，40 個循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果表示為 2－△△ct，其中ΔΔCt=（Ct，的基因－Ct，管家基因）試驗(yàn)組－（Ct，目的基因－Ct，管家基因）對照組。

反應(yīng)條件：95℃10 min，40個循環(huán)：95℃15 s，60℃1 min，循環(huán)終止，加熔解曲線。

1.2.4 PGD和LDHA基因組織表達(dá)譜的構(gòu)建

將常溫組不同個體的大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的cDNA分別混合，獲得了7個cDNA池，分別以這7個cDNA池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PGD和LAHDA基因冷誘導(dǎo)后表達(dá)變化

將常溫組和低溫組不同個體的腿肌的cDNA分別混合，獲得2個cDNA池，分別為常溫民豬（CM）和低溫民豬（DM）組。以這2個cDNA池為模板，進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 民豬PGD基因的組織表達(dá)譜

民豬的PGD基因在不同組織內(nèi)擴(kuò)增的PCR結(jié)果見圖1。從圖1可見，PGD基因在所檢測的7個組織內(nèi)均有表達(dá)，而且表達(dá)水平均較高。

第1～7泳道:β-actin基因在大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的表達(dá)水平；第8泳道:DL2000 Marker；第9～15泳道:PGD基因在大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的表達(dá)水平Lane 1－7:The expression of β-actin gene in large intestine,leg muscle,lung,fat,heart,spleen and liver;Lane 8:DL2000 marker;Lane 9－15:The expression of PGD gene in large intestine,leg muscle,lung,fat,heart,spleen and liver

2.2 民豬LDHA基因的組織表達(dá)譜

民豬的LDHA基因在不同組織內(nèi)擴(kuò)增的PCR結(jié)果見圖2。從圖2可見，基因在所檢測的7個組織內(nèi)均有表達(dá)，在肺和肝臟的表達(dá)水平略高。

圖2 LDHA基因的組織表達(dá)譜Fig.2 Expression pattern of LDHA

2.3 冷誘導(dǎo)后PGD和LDHA基因的表達(dá)變化

利用Real－time PCR方法對PGD和LDHA基因在常溫民豬（CM）和低溫民豬（DM）的腿肌內(nèi)的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測，PGD和LDHA基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖3和圖4。檢測結(jié)果如圖5和圖6所示，采用配對樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，PGD基因在民豬的常溫組和低溫組之間差異顯著（P＜0.05）?？梢姡褙i的PGD基因在低溫冷誘導(dǎo)后表達(dá)顯著增加；而LDHA基因在低溫冷誘導(dǎo)后表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖3 PGD基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig.3 Amplification plots and dissociation curve of PGD

圖4 LDHA基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig.4 Amplification plots and dissociation curve of LDHA

圖5 低溫誘導(dǎo)后PGD基因的表達(dá)變化Fig.5 Expression of PGD gene after cold-induced

圖6 低溫誘導(dǎo)后LDHA基因的表達(dá)變化Fig.6 Expression of LDHA gene after cold-induced

3 討論與結(jié)論

PGD基因廣泛表達(dá)于哺乳動物、植物和微生物。該酶位于動物細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠和線粒體上，位于植物的葉綠體上。它廣泛的表達(dá)于所有組織和血細(xì)胞內(nèi)，是一種看家酶[12]，是磷酸戊糖旁路代謝的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH），用于各種生物合成及維持血紅蛋白和紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[13]。血細(xì)胞中缺乏PGD，臨床上通常會表現(xiàn)為溶血性貧血。本試驗(yàn)所檢測的大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織內(nèi)，該基因均高水平表達(dá)，這一點(diǎn)與其他已知的看家酶特點(diǎn)相符，說明該基因在民豬上的表達(dá)并不存在組織特異性。但馬建崗在家雞上的研究顯示PGD在家雞胚胎期和未成年之前不顯示明顯的同工酶區(qū)帶[14]，成年之后僅在部分組織中出現(xiàn)活性帶；任立杰等也發(fā)現(xiàn)PGD在奶牛泌乳7 d時的活性要顯著高于其他時間點(diǎn)[15]，這說明PGD基因的表達(dá)在不同物種間還是存在一定差異的。在本研究中，民豬經(jīng)低溫冷誘導(dǎo)后，肌肉組織中的PGD基因的表達(dá)水平顯著升高。因?yàn)樵摶蛟谪i上以及其他哺乳動物上的相關(guān)研究報道非常少，主要都集中在對人的PGD缺乏癥的篩查、治療和機(jī)理研究上[16－17]。但是在植物上關(guān)于該基因的研究報道較多，所以我們參考了在植物上的相關(guān)研究結(jié)果。2009年林元震等報道了楊樹G6PDH基因啟動子區(qū)序列，他們發(fā)現(xiàn)該序列除了具有啟動子的基本元件TATA－box、CAAT－box外，還包含多個脅迫誘導(dǎo)元件，如低溫誘導(dǎo)元件LTR，抗凍、缺水、脫落酸、抗寒元件MYB和MYC，以及光響應(yīng)元件L－box、G－box、3AF－1、TC豐富區(qū)等[18]。而且該基因的超表達(dá)，可以顯著提高煙草的抗寒凍性[19]。但由于目前豬的PGD基因序列還不全，還無法進(jìn)行更深入的研究，但從本結(jié)果來看，將其作為一個影響民豬抗寒特性的候選基因進(jìn)行研究具有一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)際意義。

脫氫酶類是生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中重要的催化劑之一，在生物體內(nèi)的氧化產(chǎn)能、解毒以及某些生理活動中起著十分重要的作用，在生產(chǎn)實(shí)踐中也有廣泛的應(yīng)用。在不同的組織中各種組分的含量和比例有所不同，它是各組織生化代謝特點(diǎn)的反映[20]。L－乳酸脫氫酶（E.C.1.1.1.27）是由基因分別位于第11號染色體上的M亞基、第12號染色體上的H亞基形成的多肽鏈所構(gòu)成的四聚體，由于各亞基在不同的組織中各種組分的含量和比例不同，形成了 LDH1（H4），LDH2（H3M1），LDH3（H2M2），LDH4（H1M3）和LDH5（M4）等5種同功酶[21]。本研究所選擇的LDHA也就是編碼M亞基的基因，因此，它也被稱作LDH-M。本研究中，LDHA基因在肺和肝臟組織的表達(dá)水平略高于所檢的其他5個組織，艾曉杰等在對白香豬的研究中發(fā)現(xiàn)，肺、脾和肝臟組織中M亞基與H亞基相比略高或相同，而在腎臟和大腸中，均是H亞基占優(yōu)勢[22－24]?？梢姡褙i與白香豬相比，LDHA的表達(dá)模式基本一致。

乳酸脫氫酶是一個較為公認(rèn)的與生物個體抗寒性有關(guān)的酶類，其在關(guān)鍵鉸鏈區(qū)的一個氨基酸替換就可以顯著改變生物個體的抗寒性[25]。本研究將其作為一個可能為影響民豬抗寒性的候選基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，民豬在被冷誘導(dǎo)后，肌肉組織內(nèi)的LDHA基因的mRNA水平出現(xiàn)了顯著的下降。這一結(jié)果與史福勝等人在對不同海拔地區(qū)的牦牛組織中LDH的活性研究結(jié)果基本一致[26]。LDH不僅能夠催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，而且還能夠調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADH）的比率，因而對細(xì)胞內(nèi)的一系列生化反應(yīng)起調(diào)節(jié)控制作用[27]。可見，當(dāng)民豬處于低溫環(huán)境時，它通過下調(diào)LDHA基因的轉(zhuǎn)錄來達(dá)到抵御寒冷的目的。

綜上所述，葡萄糖－6－磷酸脫氫酶在民豬的肌肉組織中受到低溫冷誘導(dǎo)后，mRNA的表達(dá)水平顯著增加，而乳酸脫氫酶A表達(dá)水平顯著下降，二者均可以考慮作為影響民豬抗寒特性的候選基因進(jìn)行研究。

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