殷立平 蘇 健 張 鑫 李必波 仇瑩瑩 劉 麗 李 慧 熊寧寧

腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮是常伴隨慢性移植腎腎病(CAN)出現(xiàn)的組織學改變［1］。盡管目前采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素受體拮抗劑(ARB)治療CAN大鼠取得滿意結(jié)果，但臨床尚無特異性的治療方法［2，3］。

大黃酸屬單蒽核類l，8-二羥基蒽醌衍生物，具有較廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗菌及抗纖維化作用［4，5］。大黃酸可降低糖尿病大鼠尿蛋白排出量，減輕腎臟肥大，縮小腎小球系膜區(qū)的面積，減小腎小球體積，降低腎小球轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達［6］;在輸尿管梗阻大鼠模型中，其亦能減輕腎小管損害和腎間質(zhì)纖維化，減少腎組織TGF-β1表達［7］。本研究擬通過觀察大黃酸對大鼠CAN的療效及致纖維化因子的影響，為臨床治療提供新的途徑。

材料與方法

模型建立 F344近交系大鼠為供體、Lewis近交系大鼠為受體，體重170～250g，均為雄性(上海實驗動物中心提供，SPF動物房飼養(yǎng))。HC-A離體腎保存液(上海中心血站)灌注保存，大鼠左腎原位異體移植，術(shù)后10 d切除受體右腎。從受體腎移植術(shù)當天開始，腹腔注射青霉素20萬單位/d，連續(xù)3d，環(huán)孢素口服液(杭州中美華東制藥)灌胃10 mg/(kg·d)，連續(xù) 10d。

實驗分組與設(shè)計 將30只腎移植大鼠分為模型組(n=16)和大黃酸治療組(n=14)。另以5只Lewis大鼠作為對照組，行右腎切除。

大黃酸由中國藥科大學提供，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢驗藥物純度在92%以上，使用前用0.5%羧基纖維素鈉生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的懸液。治療組每日固定時間以灌胃給藥方式給予大黃酸［100 mg/(kg·d)］;模型組及對照組以0.5%羧基纖維素鈉生理鹽水灌胃，共給藥4月。

標本留取

血、尿標本 腎移植成功及藥物治療開始后，每月收集24h尿和血標本。尿標本采用金屬代謝籠收集后記錄尿量并取10 ml 5 000 r/min離心10 min去除沉渣并分裝，-20℃冰箱保存。血標本以玻璃毛細管(直徑1.0 mm)經(jīng)大鼠眶后靜脈叢采取，6h內(nèi)離心，分離血清并于-20℃冰箱保存待測。

腎組織標本 術(shù)后2月宰殺兩組大鼠均取左腎組織;術(shù)后4月宰殺各組剩余大鼠。腎組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，切片厚約2 μm，行 HE、PAS、Masson染色;余腎組織置于液氮中保存。

實驗室檢查

一般指標 每月定期檢測尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、血尿素氮、血胱抑素。

腎組織病理 采用Banff 2009分類［8］，將腎小管萎縮(ct)、間質(zhì)纖維化(ci)及間質(zhì)炎癥(i)分別積分(0，1，2，3)。

腎組織TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和纖維連接蛋白(FN)表達及定量分析 采用常規(guī)免疫組化法，分別觀察腎組織TGF-β1、CTGF和FN表達，并行半定量評分:0分:微弱染色或不染色;1分:陽性面積＜25%;2分:陽性面積25% ～50%;3分:陽性面積50% ～70%;4分:陽性面積＞70%。每張切片觀察10個視野并計算平均得分。

腎組織 TGF-β1、CTGF、FN mRNA 表達 采用RT-PCR法。取液氮凍存腎組織，Trizol法提取RNA(Invitrogen，所有操作按說明書進行)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)操作要求進行。β肌動蛋白(β-actin)引物:Forward Primer:5’-CCGTAAAGACCTCTA TGCCAACA-3’;ReversePrimer:5’-CGGACTCATCGTACT CCTGCT-3’;TGF-β1 引物:Forward Primer:5’-GAGAGCC CTGGATACCAACTACTG -3’，ReversePrimer:5’-GTGTGTCCAGGCTCCAAATGTAG-3’;CTGF 引 物Forward Primer:5’-CCGACTGGAAGACACATTTG-3’，Reverse Primer:5’-CCAGCCTGCAGAAGGTATTG-3;FN引物:Forward Primer:5’-GGGATCAAAGGAAACACAG-3’，Reverse Primer:5’-AGACGGCAAAAGAAAGCAG-3’。反應(yīng)條件:95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，循環(huán)40次。所有基因均需與內(nèi)參進行比對后統(tǒng)計。各基因相對于內(nèi)參 β-actin 在不同組別中表達水平(2-ΔΔCt)用±s表示。

統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。多樣本比較采用One Way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

大黃酸對腎移植大鼠腎功能及尿蛋白的影響與正常大鼠相比，移植后大鼠SCr及尿蛋白定量明顯升高。不同時期大黃酸治療組大鼠移植腎功能變化不大，但與同期模型組大鼠相比，各項指標皆優(yōu)于模型組(表1)。

大黃酸對腎移植大鼠腎臟病理的影響 2月時大黃酸治療組大鼠腎間質(zhì)炎癥較模型組輕，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化與模型組無明顯差異;4月時大黃酸治療組大鼠腎間質(zhì)纖維化較模型組明顯改善，兩組間存在顯著差異(P＜0.01);間質(zhì)炎癥亦較模型組輕(表2)。

大黃酸對 CAN 大鼠腎組織 TGF-β1、CTGF、FN蛋白質(zhì)表達水平的影響 對照組大鼠腎臟組織切片免疫組化染色僅見少量腎小管上皮細胞胞質(zhì)或間質(zhì)區(qū)域表達CTGF、TGF-β1及FN。大黃酸治療組及模型組大鼠CTGF主要表達于腎間質(zhì)區(qū)域，大黃酸治療2月時，兩組大鼠腎組織CTGF表達無明顯差異;大黃酸治療4月時，治療組腎組織CTGF表達明顯低于模型組。TGF-β1主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì)、胞膜、部分腎小球系膜區(qū)及管周毛細血管壁。半定量分析顯示，大黃酸治療組與模型組相比無顯著差異;FN表達以腎小管間質(zhì)區(qū)域為主，少量表達于腎小球系膜區(qū)。統(tǒng)計學分析顯示，術(shù)后4月時，大黃酸治療組FN表達明顯低于模型組(表3)。

表1 大鼠腎移植術(shù)后腎功能及尿蛋白定量變化

表2 大鼠腎移植術(shù)后腎臟組織學改變

大黃酸治療不同時期對CAN大鼠腎組織TGF-β1、CTGF、FN mRNA表達的影響 模型組及大黃酸治療組大鼠腎組織TGF-β1 mRNA的表達隨著病程的進展而升高，但兩組間不同時期無明顯差異;兩組CTGF mRNA的表達在術(shù)后2月時無明顯差異，但4月時大黃酸組CTGF mRNA的表達明顯低于模型組，兩組間比較存在顯著差異。模型組及大黃酸治療組大鼠腎組織FN mRNA的表達隨著病程的進展而升高，不同時期大黃酸組大鼠腎組織FN mRNA的表達要低于模型組，于4月時大黃酸治療組大鼠腎組織FN mRNA的表達要顯著低于模型組，兩組比較有統(tǒng)計學差異(表4)。

表3 大黃酸對CAN大鼠腎組織CTGF、TGF-β1、FN表達的影響

表4 不同時期大黃酸治療對CAN大鼠腎組織CTGF、TGF-β1、FN mRNA表達的影響

討 論

1993年，Dennis等［9］采用 Fisher 344 和 Lewis兩種近交系大鼠建立了標準的CAN模型，是目前世界公認研究CAN的最佳模型之一。本研究利用顯微外科技術(shù)進行F344-Lewis大鼠左腎原位移植，術(shù)后進行功能檢測發(fā)現(xiàn)移植組蛋白尿增加、SCr升高;腎臟組織學表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化，間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，腎小球基膜增厚、硬化，毛細血管袢閉塞，腎小管萎縮退化;RT-PCR檢測顯示細胞外基質(zhì)膠原Ⅰ、Ⅲ及FN mRNA含量明顯增加。實驗數(shù)據(jù)表明，本研究已成功復制出類似于人類CAN的大鼠模型。

腎臟纖維化在慢性腎臟病進展為終末期腎功能衰竭中有重要作用，其機制主要涉及三個環(huán)節(jié):(1)炎癥細胞浸潤、腎固有細胞增生、凋亡及表型轉(zhuǎn)化;(2)致纖維化因子，如TGF-β1、CTGF及單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)等表達上調(diào);(3)細胞外基質(zhì)的積聚與降解失衡［10］。

本研究在建立大鼠CAN模型的基礎(chǔ)上，首次觀察大黃酸對CAN的治療作用。結(jié)果顯示，大黃酸治療早期即可改善CAN大鼠腎功能，炎癥細胞浸潤及腎間質(zhì)纖維化明顯改善，F(xiàn)N沉積明顯低于對照組。

本研究觀察到不同時期大黃酸治療組腎組織炎細胞浸潤要明顯輕于模型組。尤其術(shù)后8周，兩組大鼠間質(zhì)損傷主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤，間質(zhì)纖維化改變相對較輕，此時大黃酸治療組炎細胞浸潤即明顯減輕，提示大黃酸具有抗炎作用。趙琪等［11］研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸能抑制內(nèi)毒素，誘導巨噬細胞白細胞介素12(IL-12)mRNA過度表達，且能使細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流降低，表明大黃酸能通過抑制細胞內(nèi)信號傳遞的強度達到抑制大鼠腹腔巨噬細胞IL-12 mRNA表達的目的。倪虹等［12］研究顯示，大黃酸對小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)白三烯C4、B4的生物合成具有較強的抑制作用，并能提高巨噬細胞內(nèi)cAMP水平，抑制其花生四烯酸代謝，同時可顯著抑制內(nèi)毒素刺激引起的細胞內(nèi)鈣增加。炎癥細胞浸潤是腎臟纖維化的啟動因素，阻斷其發(fā)生及發(fā)展必然可阻止腎臟纖維化的進展。這可能是大黃酸抗腎臟纖維化的機制之一。

TGF-β1是最主要的致纖維化因子。作為TGF-β1的下游效應(yīng)因子，CTGF介導了TGF-β1部分生物學功能(如促進纖維細胞增生及細胞外基質(zhì)產(chǎn)生)。因此，兩者皆與腎臟纖維化密切相關(guān)。

我們首先觀察了大黃酸對TGF-β1及CTGF的影響，結(jié)果顯示無論蛋白質(zhì)還是基因水平，大黃酸皆不影響TGF-β1的表達。該結(jié)果與以往結(jié)果不同。既往研究顯示，大黃酸可抑制輸尿管梗阻模型大鼠［7］、糖尿病腎病大鼠［13］及肝臟纖維化大鼠模型［14］腎臟及肝臟組織中TGF-β1的表達，并提出大黃酸為延緩組織纖維化的主要原因。本研究的結(jié)果與之不同的原因尚不清楚，但值得注意的是，我們觀察到大黃酸可明顯抑制CAN大鼠模型移植腎組織中CTGF的表達。

TGF-β1誘導CTGF表達的機制可能和TGF-β1反應(yīng)元件及Smads蛋白的活化有關(guān)，在多種細胞的CTGF啟動子序列的-162和-128位點之間存在特異性的 TGF-β1 反應(yīng)元件(TβRE)，它是 TGF-β1 誘導CTGF表達所不可少的。因此大黃酸是否通過對TGF-β1反應(yīng)元件及Smads蛋白活化的影響而特異性地抑制CTGF的表達，值得我們進一步研究。

本研究初步結(jié)果顯示，大黃酸可通過抑制炎癥細胞浸潤、抑制致纖維化因子CTGF等途徑對抗CAN大鼠腎間質(zhì)纖維化，改善腎功能及腎組織慢性病變。

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