程玲，徐玉茵，高勇,2，劉海濤，張娟麗 ，周靜

1.河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 生物室，河南 鄭州 450003；2.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310027

一次性注射器已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)，其質(zhì)量的好壞與人民群眾的生命安全息息相關(guān)。一次性使用注射器屬于體外與體內(nèi)相接觸中間接與血液接觸類器械，作用時(shí)間為A類（<24h）[1]。依據(jù)GB/T16886.1-2001《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分:評(píng)價(jià)與試驗(yàn)》[2-3]，我們選擇了體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)等對(duì)其生物相容性進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)樣品

選擇17批一次性使用注射器，來源于國家抽驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)儀器和所需材料

采用超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1C），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，型號(hào)：3111），小鼠成纖維細(xì)胞L-929（購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫），酶標(biāo)儀（Tecan公司，型號(hào)：Sunrise RC梯度），MEM/EBSS培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），胎牛血清（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），胰蛋白酶（Thermo），MTT溶液（Sigma公司），完全弗氏佐劑（Sigma公司），植物油（天津嘉里糧油工業(yè)有限公司），雄性豚鼠(河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：0007273)，日本大耳白(河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：0002677），昆明種小鼠（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證：0000909）。

2 試驗(yàn)樣品的制備[4]

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

同一批號(hào)取一次性注射器3支，浸提介質(zhì)為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，無菌條件下，抽取細(xì)胞培養(yǎng)液至最大刻度線處，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中24h。陽性對(duì)照用5%二甲基亞砜（DMSO），陰性對(duì)照材料選用高密度聚乙烯，取高密度聚乙烯適量，按0.2g/mL加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱浸提24 h。

2.2 急性全身毒性試驗(yàn)

浸提介質(zhì)為0.9%的氯化鈉注射液，同一批號(hào)取注射器10支，分別加0.9%的氯化鈉注射液至公稱容量并把芯桿最大容量，兩端封閉，置121℃恒溫箱中保溫1h后取出，把浸提液移入無菌的三角燒瓶內(nèi)，供24h內(nèi)使用。同法操作制備植物油浸提液和浸提介質(zhì)對(duì)照液。

2.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

浸提介質(zhì)為0.9%的氯化鈉注射液，同一批號(hào)取注射器3支，分別加0.9%的氯化鈉注射液至公稱容量，兩端封閉，振搖3次，置121℃恒溫箱中保溫1h后取出，供2h內(nèi)使用。同法操作制備植物油浸提液。取對(duì)照液0.9%氯化鈉和植物油各10mL放于無菌三角瓶中，同上方法放置。

2.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)最大劑量試驗(yàn)

浸提方法同皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)，皮內(nèi)誘導(dǎo)階段試劑的配置，注射弗氏完全佐劑與生理鹽水以50:50體積比混合的穩(wěn)定乳化劑，試驗(yàn)樣品液以50:50的體積與穩(wěn)定乳化劑混合后進(jìn)行皮內(nèi)注射。

3 試驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)[5]

選取17批國家抽驗(yàn)的注射器，取生長旺盛的小鼠成纖維細(xì)胞L929，胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL，以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，96孔板邊緣孔全部加入無菌PBS200μL，然后置5%CO2培養(yǎng)箱中孵育37℃/24h?？瞻讓?duì)照組用RPMI1640培養(yǎng)液交換。陰性對(duì)照組用高密度聚乙烯浸提液交換，陽性對(duì)照組用5%DMSO浸提液。樣品試驗(yàn)組分別用體積分?jǐn)?shù)100%、50%（即按1:1用含細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋）的樣品浸提液每孔100μL交換，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)試驗(yàn)樣品組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組及空白對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行顯微檢查，48h后每孔加入20μL（5 mg/mL）MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5h，小心吸去孔內(nèi)液體，每孔加入200μL DMSO，振蕩10 min ，用酶標(biāo)儀主波長570nm ，參考波長630nm處檢測(cè)吸光度OD值，取6孔平均值。按下列公式計(jì)算相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR ，RGR =實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD 值×100 %） 。根據(jù)RGR值，按表1 評(píng)分定出材料的毒性級(jí)別。

表1 細(xì)胞相對(duì)增殖度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

3.2 急性全身毒性試驗(yàn)[6]

隨機(jī)選取5批國家抽驗(yàn)的注射器，選用昆明種小鼠，體重17～20g，隨機(jī)將小鼠分為樣品組和對(duì)照組，每組10只，其中，各樣品組5只小鼠由尾靜脈恒速注射材料浸提液，對(duì)照組5只注射生理鹽水對(duì)照液；另外各組5只由腹腔分別注入植物油浸提液和植物油對(duì)照液。注射量均為50mL/kg。于注射后4h、24h、48h和72h 觀察小白鼠運(yùn)動(dòng)是否減少，觀察并記錄試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)，在72h時(shí)稱量動(dòng)物體重量。

3.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)[7]

隨機(jī)選取5批國家抽驗(yàn)的注射器，日本大耳白兔15只，用75%酒精消毒皮膚暴露區(qū)域，在每只兔脊柱一側(cè)選10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2cm，前5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射氯化鈉樣品浸提液，后5個(gè)點(diǎn)注射氯化鈉對(duì)照液。在每只兔的脊柱另一側(cè)注射植物油制備的樣品浸提液和植物油對(duì)照液，操作步驟同上。每點(diǎn)注射量0.2mL，注射后24h、48h、72h觀察注射部位的紅斑和水腫的組織反應(yīng)評(píng)分，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。72h評(píng)分后，分別將每一試驗(yàn)樣品和溶劑對(duì)照的全部紅斑與水腫記分相加，再除以18〔3（動(dòng)物數(shù)）×3（觀察期）×2（記分類型）〕，計(jì)算出每一試驗(yàn)樣品和每一對(duì)應(yīng)溶劑對(duì)照的綜合平均記分。

3.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)[7]

隨機(jī)選取5批國家抽驗(yàn)的注射器，每組10只豚鼠；另選5只豚鼠做對(duì)照。皮內(nèi)誘導(dǎo)階段：每只豚鼠在約2 cm×4 cm剪毛區(qū)內(nèi)注射3排（每排2個(gè)注射點(diǎn)），第1排注射0.1mL注射弗氏完全佐劑（FCA）與生理鹽水，以50:50體積比混合的穩(wěn)定乳化劑，第2排注射0.1mL樣品浸提液，對(duì)照組注射生理鹽水，第3排注射0.1mL樣品浸提液（對(duì)照生理鹽水）與穩(wěn)定乳化劑的等比混懸液。局部誘導(dǎo)階段：注射1周后，試驗(yàn)區(qū)用10%的十二烷基硫酸鈉進(jìn)行預(yù)處理，按摩導(dǎo)入皮膚，然后用樣品浸提液，將20mm×40mm濾紙片浸透后局部貼敷于每只動(dòng)物的去毛背部試驗(yàn)區(qū)的誘導(dǎo)注射點(diǎn)部位。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于（48±2）h后除去包扎帶和敷貼片。對(duì)照組使用生理鹽水同法操作。激發(fā)階段：誘導(dǎo)14 d后，每只以樣品浸提液或?qū)φ找壕植抠N敷于誘導(dǎo)階段未試驗(yàn)部位，封閉式包扎帶固定，并于24h除去包扎帶和敷貼片。除去包扎帶后24 h、48h 觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況。按Magnusson和Kligman皮膚致敏的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級(jí)。

3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長好，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形；而陽性對(duì)照組細(xì)胞很少貼壁，大部分細(xì)胞成圓形，核固縮、死亡細(xì)胞明顯增多。有4批細(xì)胞毒性較大，其余的細(xì)胞毒性都在正常范圍之內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)果，見表2。

表2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

4.2 急性全身毒性試驗(yàn)

所有實(shí)驗(yàn)小鼠均無死亡，1組4只、2組3只、5組1只動(dòng)物精神不好，體質(zhì)量有所減輕，有輕微反應(yīng)；4組動(dòng)物整體體質(zhì)量增長較少；其他動(dòng)物精神狀態(tài)良好，活動(dòng)、進(jìn)食及大小便均正常，無驚厥、癱瘓、呼吸抑制等毒性反應(yīng)，體質(zhì)量均有不同程度的增加，試驗(yàn)結(jié)果，見表3。

表3 試驗(yàn)樣品對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

表3 試驗(yàn)樣品對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

組別 生理鹽水 植物油注射前 注射后72h 注射前 注射后72h 1組 19.72±1.56 20.48±2.83 17.98±0.64 18.13±0.95 2組 19.63±1.60 20.70±3.30 17.88±0.88 20.51±1.13 3組 19.98±2.33 23.33±3.60 17.93±1.44 20.24±2.07 4組 19.47±1.81 20.48±2.04 18.12±1.31 19.87±1.37 5組 19.98±1.86 22.54±2.41 17.84±0.48 20.01±1.45對(duì)照組 20.01±2.00 21.74±2.66 18.27±1.39 21.79±1.61

4.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

每一試驗(yàn)樣品：氯化鈉浸提液與氯化鈉對(duì)照平均記分之差均為0；植物油浸提液與植物油對(duì)照平均記分之差也均<1.0（分別為0.3、0.4、0.2、0.3、0.2）。所以在本試驗(yàn)條件下，樣品浸提液對(duì)皮膚無刺激作用。

4.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

陰性對(duì)照組動(dòng)物記分均為0，試驗(yàn)組動(dòng)物記分均為0，所以，在本試驗(yàn)條件下，樣品浸提液對(duì)豚鼠無遲發(fā)型致敏作用。

5 討論

在國家抽驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)（急性毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)和致敏試驗(yàn)）相結(jié)合的方法，補(bǔ)充做了一些試驗(yàn)來探究一次性使用注射器的生物相容性。

不少檢測(cè)機(jī)構(gòu)在檢驗(yàn)一次性使用注射器的細(xì)胞毒性時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)送檢樣品的細(xì)胞毒性呈中度或重度，不符合國家標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)調(diào)查分析，注射器細(xì)胞毒性不合格的原因可能有以下3方面因素：

（1）目前，一次性使用注射器的原材料主要是聚丙烯（PP），為了降低生產(chǎn)成本，可能會(huì)添加質(zhì)量較差的PP材料。

（2）注射器滅菌的過程中，PP和橡膠活塞經(jīng)常吸附一定量的環(huán)氧乙烷（EO），如果解析時(shí)間不夠的話，殘留的EO就會(huì)產(chǎn)生較大的毒性。

（3）在注射器生產(chǎn)過程中，膠塞上使用的硅油不合格，使用工業(yè)硅油代替醫(yī)用硅油，使細(xì)胞毒性增加。也有文獻(xiàn)[8]研究表明，注射器細(xì)胞毒性較大的原因?yàn)榛钊南匆簹埩簟＝ㄗh企業(yè)在生產(chǎn)中使用合格的原料，增加EO解析時(shí)間，同時(shí)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，清除殘留洗液。

由于在以往的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高溫對(duì)這一類材料有一定影響，所以本次選取注射器在121℃下浸提1h進(jìn)行試驗(yàn)，雖然致敏試驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常，但個(gè)別產(chǎn)品的急性毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)有不同程度的反應(yīng)，其原因，可能是不同材質(zhì)高溫浸提還是有影響的。建議在注射器的國家標(biāo)準(zhǔn)中增加體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和體內(nèi)相關(guān)試驗(yàn)，以較全面地評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1]奚廷斐.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[J].中國醫(yī)療器械信息,1999,5(3):4-9.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.1-2001《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分:評(píng)價(jià)與試驗(yàn)》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版出,2001.

[3]李彤,等.40株腸球菌應(yīng)用兩種儀器鑒定結(jié)果的比較研究[J].中國醫(yī)療設(shè)備,2009,24(3):55-57.

[4]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.12-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分:樣品制備與參照樣品》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分:生物學(xué)試驗(yàn)方法》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

[6]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.11-1997《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分:全身毒性試驗(yàn)》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1997.

[7]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

[8]何華紅,李薇,吳婷.一次性使用醫(yī)用注射器活塞體外細(xì)胞毒性檢測(cè)[J].中國醫(yī)療器械雜志,2010,34(2):123-125.