盛芝娜，潘怡娜，魏曉慧，徐宇虹（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海市200240）

基因治療（Gene therapy）和基因輸送（Gene delivery）是20世紀(jì)的新興研究領(lǐng)域，自1992年Stribling等[1]首次證明呼吸道基因給藥的可行性以來，已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于多種呼吸道局部及全身性疾病的治療中，如肺部囊性纖維化、肺癌、哮喘等[2～4]。已報(bào)道[5]的基因呼吸道給藥方式主要有滴鼻給藥、氣道插管給藥、霧化吸入給藥等，但適用于耐壓定量氣霧（pMDI）裝置的基因給藥制劑還未見文獻(xiàn)報(bào)道。pMDI是吸入給藥裝置的一種，要求將藥物與適宜的拋射劑混合裝于具有特制閥門系統(tǒng)的耐壓容器中，使用時(shí)借助拋射劑的壓力將內(nèi)容物呈霧狀噴出，患者配合呼吸主動(dòng)吸入。pMDI氣霧劑的主要特點(diǎn)是在呼吸道分布廣泛且均勻，給藥劑量準(zhǔn)確，同時(shí)攜帶、使用也很方便。

制備適用于pMDI裝置的基因給藥制劑所面臨的最大挑戰(zhàn)是：常用的基因載體都是水溶性，無法與拋射劑、助溶劑互溶灌裝成氣霧劑使用，因此研制出疏水性的基因載體是當(dāng)務(wù)之急。本文根據(jù)Bligh and Dyer萃取原理[6]，改良后發(fā)展了一種新的陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合物的制備方法，對(duì)制得的載體系統(tǒng)進(jìn)行了表征，并初步評(píng)價(jià)了灌裝后的氣霧劑的毒性及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分布儀（英國(guó)Malvern公司）；UV-21.2PC紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Unico公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；單管式化學(xué)發(fā)光分析儀（德國(guó)Berthold公司）；BCM-100生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；氣霧罐、定量閥及觸動(dòng)器（蘇州萬通Aptar定量閥系統(tǒng)有限公司）；氣霧灌裝機(jī)（上海華新氣霧劑有限公司）。

1.2 試藥

陽離子脂質(zhì) DOTAP（1，2-dioleoyl-3-trimethyl-ammonium-propane，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：086K5200，純度：＞99%）；熒光素酶質(zhì)粒pGL3-Control、熒光素酶檢測(cè)底物及細(xì)胞裂解液（美國(guó)Promega公司）；氟利昂F12（瑞麗氣體有限公司）；RPM I 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司）；MTT（北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司）；三氯甲烷、甲醇、異丙醇、無水乙醚、二甲亞砜等試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞模型

人肺腺癌細(xì)胞H1299（貼壁生長(zhǎng)）由中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞所提供。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。試驗(yàn)細(xì)胞取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合物及其氣霧劑的制備

Bligh and Dyer萃取法[6]是將氯仿、甲醇、水以一定比例混合得到單相體系的過程，Reimer等[7]已應(yīng)用該法制備得到疏水性的陽離子脂質(zhì)/DNA的復(fù)合物。據(jù)此，筆者對(duì)該法進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以氯仿-異丙醇-水替代氯仿-甲醇-水形成單相體系制備陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合物時(shí)，既可以獲得適宜大小的粒子，又可以顯著提高質(zhì)粒DNA的包封率。

取0.5mg pGL3-Control溶解于水中，按氮-磷比（N/P ratio）＝1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1分別取DOTAP適量溶于氯仿，將氯仿-異丙醇-水以體積比1∶2.6∶1混合?；旌蠁蜗嘣谑覝叵鲁浞址磻?yīng)30m in后，再加入等量的氯仿和水，于4℃、相對(duì)離心力2 700 g條件下離心7m in分層。分離下層相，旋蒸除去有機(jī)溶劑后再用2m L無水乙醚溶解；將該溶液轉(zhuǎn)移到氣霧瓶中，選用50μL的定量閥，用氣霧灌裝機(jī)封口后灌入一定量的拋射劑氟利昂（制劑溶液∶拋射劑＝1∶6，質(zhì)量比）[8]制得氣霧劑。氣霧劑可以在室溫下保存，使用前倒置一夜以保證每噴定量。

2.2 DOTAP/DNA復(fù)合物的表征

用定磷法[9]測(cè)定制備的有機(jī)相中DNA的含量，按公式：載藥率＝有機(jī)相中DNA含量/投藥量×100%，計(jì)算DOTAP/DNA復(fù)合物裝載DNA的效率。用激光粒度分布儀測(cè)定制備所得的DOTAP/DNA復(fù)合物在乙醚溶劑中的粒徑，以及氣霧劑噴出后在水相中收集到的復(fù)合物的粒徑。所有數(shù)據(jù)為連續(xù)制備的3批制劑的參數(shù)測(cè)定平均值，詳見表1。

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA復(fù)合物的表征參數(shù)（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA復(fù)合物的表征參數(shù)（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表征參數(shù)氣霧劑水相收集液中平均粒徑/nm 639.400±85.657 245.200±58.830 397.500±139.400 714.900±56.510 1 966±708 N/P比1∶1 2∶1 4∶1 8∶1 16∶1 DOTAP/mg 1.040 2.080 4.160 8.320 16.640載藥率/%37.400±0.900 72±1.580 67.400±1.720 57.100±1.321 45±1.208乙醚溶劑中平均粒徑/nm 484.800±91.060 188.700±42.770 263.400±59.610 563.100±128.230 1 673±356.112

由表1可見，當(dāng)陽離子脂質(zhì)DOTAP和DNA以N/P比2∶1和4∶1混合制備時(shí)，得到的DOTAP/DNA復(fù)合物及其氣霧劑具有較高的載藥率，且粒徑分布較穩(wěn)定均一。

2.3 氣霧劑的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

由于氣霧劑中所含的乙醚等溶劑本身具有一定的細(xì)胞毒性，所以通過預(yù)試驗(yàn)考察權(quán)衡了溶劑毒性與轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系，最終選擇了毒性較低且能保證轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)的每孔4μg DNA（6孔板）的投藥量，來評(píng)價(jià)氣霧劑的細(xì)胞毒性大小。用經(jīng)典的MTT法測(cè)定：將不含DOTAP/DNA復(fù)合物，即僅罐裝等量無水乙醚的空白氣霧劑作為陰性對(duì)照組，N/P比為2∶1、4∶1的氣霧劑為試驗(yàn)組；H1299以2×104個(gè)/m L的細(xì)胞濃度、每孔2m L加入6孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基，每孔噴入氣霧劑各6噴（每噴含有0.667μg DNA量），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔；孵育4 h后，置換為1.5m L新鮮的完全培養(yǎng)基，24 h后，每孔加入5mg·m L－1的MTT 150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，再加入二甲亞砜1.5m L，溶解沉淀。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490、650 nm波長(zhǎng)條件下分別測(cè)定每孔的光密度（OD），其中490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，650 nm為參比波長(zhǎng)。以滴加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的細(xì)胞作為空白對(duì)照（100%），按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率：細(xì)胞相對(duì)存活率＝（試驗(yàn)組OD490nm－試驗(yàn)組OD650nm）/（空白對(duì)照組OD490nm－空白對(duì)照組OD650nm）×100%，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各組細(xì)胞相對(duì)存活率結(jié)果（n＝3）Fig 1 Relative cellsurvival rate of each group（n＝3）

由圖1可知，陰性對(duì)照組即空白氣霧劑的毒性主要是由氣霧噴力及有機(jī)試劑導(dǎo)致的，但基本可以保證細(xì)胞（95.600±7.300）%的存活率；N/P比為2∶1和4∶1時(shí)DOTAP/DNA復(fù)合物氣霧劑分別可以維持（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%的存活率。其細(xì)胞毒性相對(duì)于陰性對(duì)照來說差異并不顯著，可見制劑本身導(dǎo)致的毒性比較小。

2.4 DOTAP/DNA氣霧劑的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率研究

H1299細(xì)胞以2×104個(gè)/m L的密度、每孔2m L傳入6孔板上，培養(yǎng)24 h。將裸DNA（pGL3-Control）溶液直接滴加至細(xì)胞板孔內(nèi)作為對(duì)照組，N/P比2∶1、4∶1的氣霧劑為試驗(yàn)組，以每孔6噴的劑量噴入。孵育4 h后置換新鮮培養(yǎng)基，同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)熒光素酶活性，以每1mg細(xì)胞蛋白的相對(duì)光單位（RLU·mg－1）來表示轉(zhuǎn)染效率的強(qiáng)度。RLU·mg－1值越高，轉(zhuǎn)染效率則越高，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 各組熒光強(qiáng)度結(jié)果與其他2組比較：＊P＜0.05Fig 2 Resultsof fluorescence intensity in each group vs.other2 groups：＊P＜0.05

圖2 結(jié)果表明，相比于裸DNA組和N/P比為4∶1的氣霧劑組，N/P比為2∶1的氣霧劑組的熒光強(qiáng)度最高，即其轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率最高，具有較好的基因轉(zhuǎn)染活性（P＜0.05）。

3 討論

呼吸道基因輸送系統(tǒng)在近20年得到不斷的發(fā)展并具有廣闊的應(yīng)用前景。吸入給藥是呼吸道給藥的主要方式之一，其相比滴鼻給藥能夠更有效地分布至下呼吸道，同時(shí)又可以避免氣道插管法的強(qiáng)侵入性[10，11]。目前吸入制劑有氣霧劑、霧化劑、噴霧劑和粉霧劑4種，氣霧劑具有易攜帶、易使用、呼吸道分布廣泛均勻等特點(diǎn)，但是在呼吸道基因輸送方面還沒得到應(yīng)有的應(yīng)用和重視，這主要與基因載體水溶性的物化性質(zhì)有關(guān)。本研究采用溫和的制備方法——改良的Bligh and Dyer萃取法，制得可以分散于有機(jī)溶劑的DOTAP/DNA復(fù)合物，并與氟利昂灌裝得pMDI氣霧劑，為pMDI應(yīng)用到呼吸道基因輸送系統(tǒng)的研究增添了新的方向和技術(shù)。

本文制備了一系列不同N/P比的DOTAP/DNA復(fù)合物，測(cè)定發(fā)現(xiàn)最高的DNA裝載效率約為（72±1.580）%，其粒徑大小為（188.700±42.770）nm；又進(jìn)一步在細(xì)胞試驗(yàn)中考察了幾種不同N/P比的氣霧劑的毒性和基因轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，N/P比為2∶1的氣霧劑能夠有效地介導(dǎo)DNA對(duì)肺癌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染。這為該氣霧劑下一步的體內(nèi)研究提供了依據(jù)，可在呼吸道局部及全身性疾病的基因治療方面進(jìn)行嘗試，如肺部囊性纖維化、肺癌、哮喘及疫苗等。

綜上所述，本試驗(yàn)采用改良的Bligh and Dyer萃取法，制得了大小均一、DNA裝載效率較高的DOTAP/DNA復(fù)合物及氣霧劑。體外研究試驗(yàn)表明，其細(xì)胞相對(duì)存活率分別維持在（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%，細(xì)胞毒性較低，同時(shí)可以顯著提高細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)染效率，預(yù)示著該pMDI氣霧劑作為呼吸道基因輸送系統(tǒng)的潛力和可行性。

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