孟利強，李晶，張淑梅，趙曉宇，王玉霞，曹旭

（黑龍江省科學院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

隨著對植物病害防治要求的提高，傳統(tǒng)抗生素作為殺菌劑顯現(xiàn)許多弊端，如容易產生耐受性或抗性菌株，有毒性等，現(xiàn)在人們越來越多地把注意力投入到一類新型物質上，即抗菌蛋白或抗菌肽［1－3］?？咕鞍谆蚩咕氖窃S多生防微生物都能分泌的一類活性物質，它具有抑制病菌的廣譜性和高效性、對人畜無毒、對環(huán)境無污染的優(yōu)良特性，且病菌對其不易產生抗性［4］。因此，抗菌蛋白在新型生物農藥的開發(fā)中具有較好的利用價值。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一類可產生豐富胞外拮抗物質的革蘭氏陽性細菌，從中分離出具有較好生防應用價值的拮抗物質，并對其進行開發(fā)利用正成為解淀粉芽孢桿菌應用研究的熱點［5－6］。

解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的一株拮抗內生細菌，經(jīng)測定，該菌產生的抗菌蛋白具有廣譜高效的抑菌活性。本文研究對其抗菌粗蛋白的理化性質和抑菌作用進行了研究，以期為該蛋白的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。研究生防細菌抗菌蛋白的性質及其對植物病原菌的拮抗作用，一方面能充分發(fā)掘有益微生物資源，將其用于植物病害生物防治；另一方面為研究抗菌蛋白的分子遺傳基礎、克隆抗菌蛋白基因以及構建轉基因工程菌奠定理論基礎［7－8］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌TF28為本研究室分離保存，12株供試植物病原菌為本研究室保存。

1.2 實驗儀器

Sigma低溫臺式離心機、UV1102紫外分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、渦旋振蕩器、HZQ－QX全溫振蕩器、HWS24電熱恒溫水浴鍋、OLYMPUS萬用顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線

將活化好的TF28菌種按5%接種量接入50mL NYD培養(yǎng)液中，在30℃，轉速為180rpm搖床上振蕩培養(yǎng)，每隔8h取2mL培養(yǎng)液兩份，一份用紫外分光光度計測定OD600吸收值，另一份經(jīng)6000rpm離心10min，收集上清液，采用杯碟法［9］測定抑菌活性。以培養(yǎng)時間為橫坐標，發(fā)酵液的OD600吸收值和抑菌活性為縱坐標作圖，分析TF28菌株培養(yǎng)時間與抗菌物質抑菌活性的關系。

1.3.2 抗菌粗蛋白的制備

取1000mL TF28菌株發(fā)酵上清液，緩慢地加入固體硫酸銨至20%飽和度，4℃靜置2h，6000rpm離心30min，分別收集上清和沉淀。在收集的上清液中再次加入固體硫酸銨，同法調節(jié)至40%，60%，80%，100%飽和度。收集每個飽和度下的沉淀物，分別將其溶解在0.02mol／L磷酸緩沖液（pH6.8）中，經(jīng)透析及聚乙二醇包埋濃縮后定容至10mL，測定各組分的抗菌活性，活性強的組分即為制備的抗菌粗蛋白，用于以下研究。

1.3.3 抗菌粗蛋白性質研究

熱穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別置于50℃、70℃、90℃和100℃水浴中處理30min，各取100μL處理后樣品用杯碟法測定其抑菌活性，以未經(jīng)熱處理的抗菌粗蛋白為對照，將對照的抑菌活性定為100%（下同）。

pH穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白用1mol／L HCl溶液和1mol／L NaOH 溶液分別調節(jié)pH 值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，置4℃過夜保存，再將各pH 值調回至中性后測定其抑菌活性。

紫外線穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白置于28WUV燈下，距離10cm處分別照射l、2、3、4、5h，測定其抑菌活性。

蛋白酶穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別用胰蛋白酶、蛋白酶K在37℃下處理30min，酶解反應濃度為1mg／mL，測定其抑菌活性。

1.3.4 抗菌粗蛋白的抑菌作用

抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的影響：制備不同濃度的抗菌粗蛋白，取抗菌粗蛋白、病原菌孢子（106個／mL）及PD液體培養(yǎng)基各300μL于1.5mL的EP管中，抗菌粗蛋白終濃度分別為553.28、276.64、138.32、69.16、34.58、17.29μg／mL。25℃靜置培養(yǎng)12h，光學顯微鏡觀察，統(tǒng)計視野內孢子的總數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù)。對照采用75%百菌清可濕性粉劑800倍稀釋液。每個處理做3個重復，計算孢子萌發(fā)率（孢子萌發(fā)率＝萌發(fā)孢子數(shù)／孢子總數(shù)）×100%。

抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響：在PD培養(yǎng)基平板中心接入病原菌塊，采用濾紙片法［10］測定抗菌粗蛋白對菌絲形態(tài)的影響：每個濾紙片上加10μL的抗菌粗蛋白，對照加無菌水。培養(yǎng)24h，用顯微鏡觀察抑菌圈周圍菌絲形態(tài)的變化。

抗菌粗蛋白對病原菌菌絲生長量的影響：PD液體培養(yǎng)基（50／250mL）中接入病原菌孢子液至終濃度104個／mL，于28℃，150rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)5h后加入抗菌粗蛋白 （終濃度為138.32μg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)7d后，收集菌絲，烘干稱重，計算菌絲生長量。

2 結果與分析

2.1 TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線

在TF28菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔8h取樣一次，分別測定培養(yǎng)液OD600吸收值及上清液抑菌活性。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600吸收值和抑菌活性為縱坐標作圖，分析TF28的培養(yǎng)時間與抗菌物質抑菌活性的關系。結果如圖1所示，在初始的24h內菌密度呈對數(shù)增長，隨后進入穩(wěn)定期。其發(fā)酵上清液抑菌活性隨著菌密度的增加而增大，但其活性在48h時達到最大值，相對于菌密度的增加，抑菌物質的產生存在滯后性，48h過后其抑菌活性稍有下降，可見TF28菌株培養(yǎng)至48h時抑菌活性最強。

圖1 菌株TF28發(fā)酵液OD600值與抑菌活性曲線

2.2 抗菌粗蛋白的制備

抗菌粗蛋白的獲得采用硫酸銨鹽析法［11］，硫銨飽和度為20%時，其粗提物抑菌活性最弱；（圖2）當酸銨鹽析飽和度為40%時，粗提物抑菌活性最強；而當硫酸銨鹽析飽和度為60%，80%和100%時，粗提物的抑菌活性都遠低于40%飽和度，由此確定，沉淀抗菌粗蛋白的最佳硫酸銨飽和度為20%～40%。

圖2 不同飽和度的硫酸銨鹽析對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響

2.3 抗菌粗蛋白性質研究

熱穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)50℃和70℃處理30min活性幾乎不變（表1），而經(jīng)90℃和100℃處理30min活性有所下降，抑菌率分別為原有活性的93.3%和85.9%，由此可見該抗菌粗蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性。

表1 抗菌粗蛋白的熱穩(wěn)定性

pH的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白在較廣pH（3～11）范圍內比較穩(wěn)定，活性均能保持在95%以上（表2），僅在強酸（pH1）和強堿（pH13）的環(huán)境中活性有所下降，分別為原有活性的86.9%和82.5%。

表2 抗菌粗蛋白的pH穩(wěn)定性

對紫外線的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)紫外線照射后不會失活，對紫外線不敏感。

對蛋白酶的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K分別在37℃下處理30min，結果顯示該抗菌粗蛋白對胰蛋白酶不敏感；而蛋白酶K處理使其活性降低，但仍能保持原有活性的79.3%，即對蛋白酶K具有一定的耐受性。

2.4 抗菌粗蛋白的抑菌作用

2.4.1 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的影響

用不同濃度抗菌粗蛋白處理水稻惡苗病菌孢子，發(fā)現(xiàn)病菌孢子的萌發(fā)率隨抗菌粗蛋白濃度的改變而改變，濃度越高孢子的萌發(fā)率越低，結果見圖3。當抗菌粗蛋白的濃度為17.29μg／mL時，孢子的萌發(fā)率為99.46%；而當抗菌粗蛋白的濃度為553.25μg／mL時，病菌孢子的萌發(fā)率僅為20.1%。該抗菌粗蛋白抑制水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的有效中濃度（EC50）為138.32μg／mL。

圖3 不同濃度抗菌粗蛋白病原孢子萌發(fā)的影響

2.4.2 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響

在PDA平板上，經(jīng)抗菌粗蛋白處理的水稻惡苗病菌菌絲變形以至破裂。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的菌絲長且致密，粗細均一，菌絲內部物質分布均勻，折光一致（圖4A）。而經(jīng)過抗菌粗蛋白處理12h后，病原菌菌絲多處出現(xiàn)膨大，菌絲粗細不均；在處理24h后菌絲出現(xiàn)腫脹，并且菌絲末端出現(xiàn)泡囊結構。隨著處理時間的延長，菌絲的畸形程度加?。▓D4B）。

圖4 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病病原菌菌絲形態(tài)的影響

2.4.3 抗菌粗蛋白對不同病原菌菌絲生長量的影響

將終濃度138.32μg／mL的抗菌粗蛋白分別接入到12株活化好的病原菌PD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7d，結果抗菌粗蛋白對12株病原菌菌絲生長均有抑制作用，對照組菌絲大量生長，實驗組僅見少量菌絲。其中對大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）抑制率最低為71.3%，對大豆根腐病菌（Fusarium oxysporumf.sp.vedolens）和水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）抑制率較高分別為93.2%和94.3%（表3）。

表3 抗菌粗蛋白對病菌菌絲生長量的抑制率

3 結論

生防解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的一株內生細菌，具有良好的實驗室生測活性，能對多種植物病原菌的生長起到抑制作用。從TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線看，菌體在24h達到穩(wěn)定期，其發(fā)酵上清液抑菌活性在培養(yǎng)48h后達到峰值且抑菌活性沒有隨菌體生長衰退而明顯下降，說明抗菌活性物質具有較高的穩(wěn)定性。利用20%～40%飽和度的硫酸銨從其發(fā)酵上清液中鹽析可獲得抗菌粗蛋白，該粗蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性，100℃處理30min后其抑菌活性仍為原有抑菌活性的85.9%；且在較廣pH（3～11）范圍內的比較穩(wěn)定，活性均能保持在95%以上；對紫外線、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K具有一定的耐受性；該抗菌粗蛋白對已測定的12種真菌均有抑制作用，對大豆根腐病菌和水稻惡苗病菌的抑制作用尤為明顯。其對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的有效抑制中濃度（EC50）為138.32μg／mL。此外，該抗菌粗蛋白能破壞病原菌菌絲結構，導致其畸形，如菌絲腫脹和末端出現(xiàn)泡囊結構等。

綜上所述，TF28菌株所產抗菌蛋白具有較高的理化穩(wěn)定性及其廣譜高效的抑真菌活性，具有良好的應用前景。對其抗菌蛋白有待于進一步開展分離純化研究，從而進行抗菌蛋白拮抗基因的克隆及其表達調控研究，為高效、多功能生防基因工程菌的構建和抗病轉基因植物的獲得提供技術支撐［12－13］。

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