孟利強(qiáng)，李晶，張淑梅，趙曉宇，王玉霞，曹旭

（黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

隨著對植物病害防治要求的提高，傳統(tǒng)抗生素作為殺菌劑顯現(xiàn)許多弊端，如容易產(chǎn)生耐受性或抗性菌株，有毒性等，現(xiàn)在人們越來越多地把注意力投入到一類新型物質(zhì)上，即抗菌蛋白或抗菌肽［1－3］?？咕鞍谆蚩咕氖窃S多生防微生物都能分泌的一類活性物質(zhì)，它具有抑制病菌的廣譜性和高效性、對人畜無毒、對環(huán)境無污染的優(yōu)良特性，且病菌對其不易產(chǎn)生抗性［4］。因此，抗菌蛋白在新型生物農(nóng)藥的開發(fā)中具有較好的利用價值。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一類可產(chǎn)生豐富胞外拮抗物質(zhì)的革蘭氏陽性細(xì)菌，從中分離出具有較好生防應(yīng)用價值的拮抗物質(zhì)，并對其進(jìn)行開發(fā)利用正成為解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用研究的熱點［5－6］。

解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的一株拮抗內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)測定，該菌產(chǎn)生的抗菌蛋白具有廣譜高效的抑菌活性。本文研究對其抗菌粗蛋白的理化性質(zhì)和抑菌作用進(jìn)行了研究，以期為該蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。研究生防細(xì)菌抗菌蛋白的性質(zhì)及其對植物病原菌的拮抗作用，一方面能充分發(fā)掘有益微生物資源，將其用于植物病害生物防治；另一方面為研究抗菌蛋白的分子遺傳基礎(chǔ)、克隆抗菌蛋白基因以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌奠定理論基礎(chǔ)［7－8］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌TF28為本研究室分離保存，12株供試植物病原菌為本研究室保存。

1.2 實驗儀器

Sigma低溫臺式離心機(jī)、UV1102紫外分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、渦旋振蕩器、HZQ－QX全溫振蕩器、HWS24電熱恒溫水浴鍋、OLYMPUS萬用顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線

將活化好的TF28菌種按5%接種量接入50mL NYD培養(yǎng)液中，在30℃，轉(zhuǎn)速為180rpm搖床上振蕩培養(yǎng)，每隔8h取2mL培養(yǎng)液兩份，一份用紫外分光光度計測定OD600吸收值，另一份經(jīng)6000rpm離心10min，收集上清液，采用杯碟法［9］測定抑菌活性。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，發(fā)酵液的OD600吸收值和抑菌活性為縱坐標(biāo)作圖，分析TF28菌株培養(yǎng)時間與抗菌物質(zhì)抑菌活性的關(guān)系。

1.3.2 抗菌粗蛋白的制備

取1000mL TF28菌株發(fā)酵上清液，緩慢地加入固體硫酸銨至20%飽和度，4℃靜置2h，6000rpm離心30min，分別收集上清和沉淀。在收集的上清液中再次加入固體硫酸銨，同法調(diào)節(jié)至40%，60%，80%，100%飽和度。收集每個飽和度下的沉淀物，分別將其溶解在0.02mol／L磷酸緩沖液（pH6.8）中，經(jīng)透析及聚乙二醇包埋濃縮后定容至10mL，測定各組分的抗菌活性，活性強(qiáng)的組分即為制備的抗菌粗蛋白，用于以下研究。

1.3.3 抗菌粗蛋白性質(zhì)研究

熱穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別置于50℃、70℃、90℃和100℃水浴中處理30min，各取100μL處理后樣品用杯碟法測定其抑菌活性，以未經(jīng)熱處理的抗菌粗蛋白為對照，將對照的抑菌活性定為100%（下同）。

pH穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白用1mol／L HCl溶液和1mol／L NaOH 溶液分別調(diào)節(jié)pH 值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，置4℃過夜保存，再將各pH 值調(diào)回至中性后測定其抑菌活性。

紫外線穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白置于28WUV燈下，距離10cm處分別照射l、2、3、4、5h，測定其抑菌活性。

蛋白酶穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別用胰蛋白酶、蛋白酶K在37℃下處理30min，酶解反應(yīng)濃度為1mg／mL，測定其抑菌活性。

1.3.4 抗菌粗蛋白的抑菌作用

抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的影響：制備不同濃度的抗菌粗蛋白，取抗菌粗蛋白、病原菌孢子（106個／mL）及PD液體培養(yǎng)基各300μL于1.5mL的EP管中，抗菌粗蛋白終濃度分別為553.28、276.64、138.32、69.16、34.58、17.29μg／mL。25℃靜置培養(yǎng)12h，光學(xué)顯微鏡觀察，統(tǒng)計視野內(nèi)孢子的總數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù)。對照采用75%百菌清可濕性粉劑800倍稀釋液。每個處理做3個重復(fù)，計算孢子萌發(fā)率（孢子萌發(fā)率＝萌發(fā)孢子數(shù)／孢子總數(shù)）×100%。

抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響：在PD培養(yǎng)基平板中心接入病原菌塊，采用濾紙片法［10］測定抗菌粗蛋白對菌絲形態(tài)的影響：每個濾紙片上加10μL的抗菌粗蛋白，對照加無菌水。培養(yǎng)24h，用顯微鏡觀察抑菌圈周圍菌絲形態(tài)的變化。

抗菌粗蛋白對病原菌菌絲生長量的影響：PD液體培養(yǎng)基（50／250mL）中接入病原菌孢子液至終濃度104個／mL，于28℃，150rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)5h后加入抗菌粗蛋白 （終濃度為138.32μg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)7d后，收集菌絲，烘干稱重，計算菌絲生長量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線

在TF28菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔8h取樣一次，分別測定培養(yǎng)液OD600吸收值及上清液抑菌活性。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600吸收值和抑菌活性為縱坐標(biāo)作圖，分析TF28的培養(yǎng)時間與抗菌物質(zhì)抑菌活性的關(guān)系。結(jié)果如圖1所示，在初始的24h內(nèi)菌密度呈對數(shù)增長，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。其發(fā)酵上清液抑菌活性隨著菌密度的增加而增大，但其活性在48h時達(dá)到最大值，相對于菌密度的增加，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生存在滯后性，48h過后其抑菌活性稍有下降，可見TF28菌株培養(yǎng)至48h時抑菌活性最強(qiáng)。

圖1 菌株TF28發(fā)酵液OD600值與抑菌活性曲線

2.2 抗菌粗蛋白的制備

抗菌粗蛋白的獲得采用硫酸銨鹽析法［11］，硫銨飽和度為20%時，其粗提物抑菌活性最弱；（圖2）當(dāng)酸銨鹽析飽和度為40%時，粗提物抑菌活性最強(qiáng)；而當(dāng)硫酸銨鹽析飽和度為60%，80%和100%時，粗提物的抑菌活性都遠(yuǎn)低于40%飽和度，由此確定，沉淀抗菌粗蛋白的最佳硫酸銨飽和度為20%～40%。

圖2 不同飽和度的硫酸銨鹽析對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響

2.3 抗菌粗蛋白性質(zhì)研究

熱穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)50℃和70℃處理30min活性幾乎不變（表1），而經(jīng)90℃和100℃處理30min活性有所下降，抑菌率分別為原有活性的93.3%和85.9%，由此可見該抗菌粗蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性。

表1 抗菌粗蛋白的熱穩(wěn)定性

pH的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白在較廣pH（3～11）范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，活性均能保持在95%以上（表2），僅在強(qiáng)酸（pH1）和強(qiáng)堿（pH13）的環(huán)境中活性有所下降，分別為原有活性的86.9%和82.5%。

表2 抗菌粗蛋白的pH穩(wěn)定性

對紫外線的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)紫外線照射后不會失活，對紫外線不敏感。

對蛋白酶的穩(wěn)定性：該抗菌粗蛋白經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K分別在37℃下處理30min，結(jié)果顯示該抗菌粗蛋白對胰蛋白酶不敏感；而蛋白酶K處理使其活性降低，但仍能保持原有活性的79.3%，即對蛋白酶K具有一定的耐受性。

2.4 抗菌粗蛋白的抑菌作用

2.4.1 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的影響

用不同濃度抗菌粗蛋白處理水稻惡苗病菌孢子，發(fā)現(xiàn)病菌孢子的萌發(fā)率隨抗菌粗蛋白濃度的改變而改變，濃度越高孢子的萌發(fā)率越低，結(jié)果見圖3。當(dāng)抗菌粗蛋白的濃度為17.29μg／mL時，孢子的萌發(fā)率為99.46%；而當(dāng)抗菌粗蛋白的濃度為553.25μg／mL時，病菌孢子的萌發(fā)率僅為20.1%。該抗菌粗蛋白抑制水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的有效中濃度（EC50）為138.32μg／mL。

圖3 不同濃度抗菌粗蛋白病原孢子萌發(fā)的影響

2.4.2 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響

在PDA平板上，經(jīng)抗菌粗蛋白處理的水稻惡苗病菌菌絲變形以至破裂。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的菌絲長且致密，粗細(xì)均一，菌絲內(nèi)部物質(zhì)分布均勻，折光一致（圖4A）。而經(jīng)過抗菌粗蛋白處理12h后，病原菌菌絲多處出現(xiàn)膨大，菌絲粗細(xì)不均；在處理24h后菌絲出現(xiàn)腫脹，并且菌絲末端出現(xiàn)泡囊結(jié)構(gòu)。隨著處理時間的延長，菌絲的畸形程度加?。▓D4B）。

圖4 抗菌粗蛋白對水稻惡苗病病原菌菌絲形態(tài)的影響

2.4.3 抗菌粗蛋白對不同病原菌菌絲生長量的影響

將終濃度138.32μg／mL的抗菌粗蛋白分別接入到12株活化好的病原菌PD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7d，結(jié)果抗菌粗蛋白對12株病原菌菌絲生長均有抑制作用，對照組菌絲大量生長，實驗組僅見少量菌絲。其中對大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）抑制率最低為71.3%，對大豆根腐病菌（Fusarium oxysporumf.sp.vedolens）和水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）抑制率較高分別為93.2%和94.3%（表3）。

表3 抗菌粗蛋白對病菌菌絲生長量的抑制率

3 結(jié)論

生防解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的一株內(nèi)生細(xì)菌，具有良好的實驗室生測活性，能對多種植物病原菌的生長起到抑制作用。從TF28菌株生長曲線與抑菌時程曲線看，菌體在24h達(dá)到穩(wěn)定期，其發(fā)酵上清液抑菌活性在培養(yǎng)48h后達(dá)到峰值且抑菌活性沒有隨菌體生長衰退而明顯下降，說明抗菌活性物質(zhì)具有較高的穩(wěn)定性。利用20%～40%飽和度的硫酸銨從其發(fā)酵上清液中鹽析可獲得抗菌粗蛋白，該粗蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性，100℃處理30min后其抑菌活性仍為原有抑菌活性的85.9%；且在較廣pH（3～11）范圍內(nèi)的比較穩(wěn)定，活性均能保持在95%以上；對紫外線、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K具有一定的耐受性；該抗菌粗蛋白對已測定的12種真菌均有抑制作用，對大豆根腐病菌和水稻惡苗病菌的抑制作用尤為明顯。其對水稻惡苗病菌孢子萌發(fā)的有效抑制中濃度（EC50）為138.32μg／mL。此外，該抗菌粗蛋白能破壞病原菌菌絲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其畸形，如菌絲腫脹和末端出現(xiàn)泡囊結(jié)構(gòu)等。

綜上所述，TF28菌株所產(chǎn)抗菌蛋白具有較高的理化穩(wěn)定性及其廣譜高效的抑真菌活性，具有良好的應(yīng)用前景。對其抗菌蛋白有待于進(jìn)一步開展分離純化研究，從而進(jìn)行抗菌蛋白拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控研究，為高效、多功能生防基因工程菌的構(gòu)建和抗病轉(zhuǎn)基因植物的獲得提供技術(shù)支撐［12－13］。

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