聶曉靜，趙筱萍，王 毅

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310058;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053)

隨著天然產(chǎn)物大規(guī)模分離制備技術(shù)與高通量篩選技術(shù)的迅猛發(fā)展［1］，天然產(chǎn)物已成為抗腫瘤藥物篩選的重要來(lái)源之一［2］。常用的抗腫瘤活性體外篩選方法主要包括 3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-di-phenyltetrazolium bromide(MTT)法和Sulforhodamine B(SRB)法等，在實(shí)際應(yīng)用中已取得了較大的成效［3］。但由于受到實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)方法的限制，難以滿足迅速發(fā)展的新藥研發(fā)對(duì)藥物高通量篩選(HTS)的要求。因此，建立合理、高效、簡(jiǎn)便的抗腫瘤藥物篩選新方法，對(duì)于抗腫瘤新藥研發(fā)具有重要意義。

熒光標(biāo)記技術(shù)因其具有簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)［4］，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并已成為高通量篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。二乙酸熒光素(FDA)是一種常用熒光染料，能穿越細(xì)胞質(zhì)膜后在胞內(nèi)被酯酶水解，因?yàn)槠渌猱a(chǎn)物不能自由通過(guò)質(zhì)膜且能夠發(fā)出熒光，因此，可用于活細(xì)胞標(biāo)記并測(cè)定細(xì)胞活力［5］。本研究發(fā)展了一種基于FDA標(biāo)記活細(xì)胞的抗腫瘤活性物質(zhì)快速篩選方法，并運(yùn)用該方法對(duì)中藥烏藥中抗腫瘤活性組分進(jìn)行了初步篩選，為從復(fù)雜中藥組分中快速發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性物質(zhì)提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 細(xì)胞熒光顯微圖像獲取平臺(tái)由浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所開(kāi)發(fā)，包括Leica DMI 6000 B(德國(guó)萊卡公司)倒置熒光顯微鏡、高精度可控電動(dòng)平臺(tái)、電荷耦合器(CCD)攝像頭(Leica DFC 310 FX)和熒光圖像拼接及識(shí)別軟件，其基本原理與文獻(xiàn)［6］類似。HP1100液相色譜系統(tǒng)，含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD檢測(cè)器。Finnigan LCQDeca XPplus質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司。胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司。熒光染料二乙酸熒光素(FDA)購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)研究所。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司。阿霉素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度97.4%。烏藥組分由浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所數(shù)字化中藥組分庫(kù)提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝腫瘤細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，置于95%O2和CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，在含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 FDA濃度的選擇 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按照3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用含不同濃度FDA的 PBS標(biāo)記細(xì)胞，每孔100 μl，F(xiàn)DA終濃度分別為:10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)各孔的熒光強(qiáng)度。

1.4 抗腫瘤藥物快速篩選系統(tǒng)

1.4.1 基于熒光的抗腫瘤藥物體外篩選方法

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液稀釋至3×104個(gè)/ml，按照3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，試驗(yàn)組每孔加入200 μl含待測(cè)組分的培養(yǎng)液，終濃度為50 μg/ml，每個(gè)組分設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，棄上清，每孔加入含 FDA 的 PBS 溶液(2.5 μg/ml)100 μl，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)各孔的熒光強(qiáng)度。按照下面的公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率:抑制率(%)=(1-加藥組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度)×100%。

1.4.2 方法學(xué)研究

1.4.2.1 線性范圍 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，按照10 000、8 000、6 000、4 000、3 000、2 000、1 000、0個(gè)/孔的細(xì)胞密度梯度接種于細(xì)胞板中，每個(gè)密度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用含F(xiàn)DA(2.5 μg/ml)的 PBS 標(biāo)記細(xì)胞，每孔 100 μl，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)各孔的熒光強(qiáng)度。以每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.4.2.2 精密度 按常規(guī)方法接種腫瘤細(xì)胞，3 000個(gè)/孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，依1.4.2.1中方法連續(xù)掃描整板60孔(舍棄邊孔)，并統(tǒng)計(jì)各孔的熒光強(qiáng)度，計(jì)算各孔熒光強(qiáng)度間的RSD，以考察該方法的精密度。

1.4.2.3 陽(yáng)性藥阿霉素抗腫瘤活性考察 按常規(guī)方法接種腫瘤細(xì)胞，3 000個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后，加藥組每孔加入200 μl含不同濃度阿霉素的培養(yǎng)液，阿霉素的終濃度分別為:4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入相同體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，按1.4.1中方法測(cè)定阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

1.4.3 烏藥組分抗腫瘤活性篩選按常規(guī)方法接種腫瘤細(xì)胞，3 000個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后，加藥組每孔加入200 μl含烏藥組分的培養(yǎng)液，烏藥組分終濃度為50 μg/ml，每個(gè)組分設(shè)3個(gè)復(fù)孔。并分別以4 μmol/L的阿霉素和0.1%的DMSO為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h，按1.4.1中方法測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值抑制率。

1.4.4 活性組分的LC/MS分析 稱取活性組分少量，用50%甲醇/水溶解至5 mg/ml，離心后，進(jìn)樣分析。色譜柱:ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm)。流動(dòng)相:A:0.05%甲酸/水;B:乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?5%溶劑B保持10 min，10～15 min內(nèi)線性升至40%，15～60 min內(nèi)線性升至100%。流速:0.8 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。離子源:ESI;掃描范圍100～1 500(m/z)。

2 結(jié)果

2.1 FDA濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 本研究考察了7個(gè)不同熒光染料濃度下的細(xì)胞熒光顯微圖像效果(如圖1所示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在FDA濃度大于2.5 μg/ml時(shí)，均能滿足鏡下觀察及后續(xù)圖像處理要求，考慮到染料濃度過(guò)高可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，故選擇2.5 μg/ml為FDA染料濃度。

2.2 方法學(xué)研究結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖2)，每孔接種細(xì)胞數(shù)在0～10 000個(gè)每孔的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與接種細(xì)胞數(shù)線性相關(guān)，計(jì)算回歸方程得 y=4665.2x+481815，r2=0.9858。連續(xù)掃描整個(gè)96孔板中60孔，發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度變化值較小，其RSD為9.41%，表明該方法具有良好的板內(nèi)精密度。

以陽(yáng)性藥阿霉素驗(yàn)證本方法的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，本方法能在比MTT和SRB法更短的時(shí)間內(nèi)(24 h)測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響，計(jì)算所得阿霉素抑制HepG2細(xì)胞增殖作用的IC50為1.78 μmol/L。

圖1 不同F(xiàn)DA濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of various FDA concentrations on fluorescence intensity

圖2 細(xì)胞密度與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系曲線Fig.2 Linearity curve between cell numbers per well and fluorescence intensity

圖3 不同濃度阿霉素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的量效曲線Fig.3 Dose-response curve of DOX on HepG2 cell line over a concentration range of 0-4 μmol/L

2.3 烏藥組分抗腫瘤活性 如表1所示，在篩選的 26 個(gè)烏藥組分中，B08、B09、B10、C06、C09、C10、C12、C13、C14、C15 這 10 個(gè)組分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率均大于50%，其中組分C13和C15在50 μg/ml的濃度下，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制率均超過(guò)了90%。

2.4 活性組分分析結(jié)果 烏藥組分C13、C15的LC/MS分析結(jié)果見(jiàn)表2，其中 m/z為312［M-H］-的分子離子峰，為抗腫瘤活性最強(qiáng)的兩個(gè)烏藥組分C13和C15中的共有峰。與文獻(xiàn)相比對(duì)后初步推斷該化合物為異波爾定堿。

3 討論

本研究建立了一種基于細(xì)胞熒光顯微圖像的抗腫瘤活性物質(zhì)快速篩選方法，并進(jìn)行了染料濃度選擇、線性范圍與精密度研究等方法學(xué)考察。該方法應(yīng)用于復(fù)雜中藥組分中抗腫瘤活性成分的篩選，從26個(gè)烏藥組分中篩選到兩個(gè)組分具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，進(jìn)一步的LC/MS分析結(jié)果提示其中的活性化合物可能為異喹啉類生物堿異波爾定堿(Norboldine)、新木姜子堿(Laurolitsine)，其中 Norboldine和 Laurolitsine為光學(xué)異構(gòu)體。已有研究表明，Norboldine對(duì)L1210和K562細(xì)胞有細(xì)胞毒作用［7］，結(jié)合分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道，初步推斷烏藥中具有抗腫瘤活性的化合物為異波爾定堿(Norboldine)。

表1 烏藥組分體外抗腫瘤活性(n=3)Table 1 Anti-tumor activity of components from Lindera aggregate in vitro(n=3)

傳統(tǒng)的體外細(xì)胞毒測(cè)定方法如臺(tái)盼藍(lán)染色法、MTT法和SRB法等的動(dòng)態(tài)范圍均為1～2 logs［8-10］，而本研究采用的FDA熒光標(biāo)記活細(xì)胞法具有4logs的動(dòng)態(tài)范圍［11］。同時(shí)，本研究采用的細(xì)胞熒光圖像收集平臺(tái)具有自動(dòng)化程度高、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，因此也更適用于抗腫瘤活性物質(zhì)的大規(guī)模篩選。此外，與傳統(tǒng)的MTT和SRB法相比，本方法能夠在更短的時(shí)間(24h)內(nèi)反映出藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞損傷的量效關(guān)系，因而更適合于抗腫瘤活性物質(zhì)的快速篩選。

表2 烏藥組分C13、C15的液相-質(zhì)譜分析Table 2 LC/MS analysis of components C13 and C15 from Lindera aggregate

綜上所述，本研究發(fā)展了一套基于熒光細(xì)胞圖像自動(dòng)收集與分析的抗腫瘤活性物質(zhì)體外篩選方法。該方法快速、穩(wěn)定并具有較好的線性范圍，可用于從復(fù)雜中藥組分中快速篩選抗腫瘤活性成分，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的研究手段。

［1］ZHU Hong-biao，CHEN Qi-gang，SUN Qiu，et al(褚洪標(biāo)，陳琪岡，孫 秋，等).High throughput preparation fornaturalproductsamples ［J］.Yunnan Chemical Technology(云南化工)，2003，30，58-60.(in Chinese)

［2］WU Zeng-ru，XU Xiao-jie(吳增茹，徐筱杰).Using affinity selection to screen new drugs in combinatorial libraries［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化學(xué))，2002，30，101-106.(in Chinese)

［3］GU Lin-na，GU Hao(顧琳娜，顧 昊).Screening method foranti-cancernaturalproducts ［J］.Herald of Medicine(醫(yī)藥導(dǎo)報(bào))，2009，28，496-498.(in Chinese)

［4］HERTZBERG R，Pope A J.High-throughput screening:new technology for the 21stcentury ［J］.Curr Opin Chem Biol，2000，4:445-451.

［5］PROFFITT R T，TRAN J V，PATRICK REYNOLDS C.A fluorescence digital image microscopy system for quantifyingrelativecellnumbersin tissue culture plates［J］.Cytometry，1996，24:204-213.

［6］JIN Y C，ZHAO X P，ZHANG Y F，et.al.A Three-Stage-Integrative (TSI) approach for the identification of hepatotoxic compounds from botanical products.［J］.Int J Toxicol，2011，30(3):287-299.

［7］GAN L S，YAO W，MO J X，et al.Alkaloids from Lindera aggregate［J］.Nat Prod Commun，2009，4，43-46.

［8］WEISENTHAL L M，MARSDEN J A，DILL P L.A novel dye exclusion method fro testing in vitro chemosensitivity of human tumors ［J］.Cancer Res，1983，43，749-757.

［9］SOBOTTKA S B，BERGER M R.Assessment of antineoplastic agents by MTT assay:partial underestimation of antiproliferative properties［J］.Cancer Chemoth Pharm，1992，30，385-393.

［10］SKEHAN P，STORRENG R，SCUDIERO D.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening［J］.J Natl Cancer Inst，1990，82，1107-1112.

［11］KESHELAVA N，F(xiàn)RGALAT，KREJSAJ.A microcomputer fluorescence-based cytotoxicity assay for preclinical testing of combination chemotherapy.Methods in Molecular Medicine，vol.110:Chemosensitivity:Vol.1:In Vitro Assays［M］.Humana Press，2005，139-153.