毛小榮，岳 偉，袁 宏，陳 紅，薛 苗

(蘭州大學第一醫(yī)院傳染科，甘肅蘭州730000)

HSC(hepatic stellate cell，HSC)的活化、轉化及增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的中心環(huán)節(jié)，已經(jīng)有大量研究顯示，TGF-β和CTGF因子是介導HSC活化的關鍵細胞因子，所以是否能抑制是RNAi治療肝纖維化的關鍵，且是較理想的靶位，尤其以 CTGF因子為最佳［1-2］。CTGF是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的致器官組織纖維化的細胞因子，它不但可以特異性的介導TGF-β的促纖維化效應，而且也不影響其抑制細胞的增殖和免疫反應的作用，還可以介導由機械應力、腎素-血管緊張素及腫瘤壞死因子-α等誘導的肝纖維化［3-4］。本研究旨在設計合成三段RNA干擾候選片段，并篩選出高效的干擾片段，運用RNA干擾技術，探討其通過尾靜脈注射是否具有抗大鼠肝纖維化作用，為今后尋找更有效的抗肝纖維化治療方法提供新策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人胎肝細胞株(L-02)來源于本實驗室凍存細胞，設計好的脫氧核苷酸序列由上海吉瑪公司合成，脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，Opti-MEM培養(yǎng)基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，ECL試劑盒為美國Pierce公司產(chǎn)品，兔抗人 CTGF抗體為美國PEPRO TECH公司產(chǎn)品，小鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗及羊抗小鼠二抗購于武漢博士德生物有限公司。SD大鼠由甘肅省中醫(yī)學院SPF級動物實驗中心提供。Trizol及兩步法 RT-PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品，肝纖維化指標放免試劑盒購自北京北方生物制品研究所，CTGF及β-actin引物由Takara公司設計及合成，CCl4為長江化工廠產(chǎn)品，其它為分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因干擾靶點的選擇及高效CTGFsiRNA干擾片段的篩選 從Genbank中獲取大鼠CTGF基因cDNA序列(NM-022266)，根據(jù)在線 Genscript siRNA Target Finder設計軟件確定靶序列。根據(jù)設計原則，結合所設計的寡核苷酸鏈在CTGFmRNA序列中的分布等因素選擇序列。

根據(jù)設計原則，結合所設計的寡核苷酸鏈在CTGFmRNA序列中的分布等因素，選擇以下3條序列并將設計好的脫氧核苷酸序列送于上海吉瑪公司合成。

siCTGF-1

正義鏈:5＇-pGCA CCA GUG UGA AGA CCU AdTdT-3＇

反義鏈:5＇-pUAG GUC UUC ACA CUG GUG CdTdT-3＇

siCTGF-2

正義鏈:5＇-pCCG CAA GAU UGG CGU GUG CdTdT-3＇

反義鏈:5＇-pGCA CAC GCC AAU CUU GCG GdTdT-3＇

siCTGF-3

正義鏈:5＇-pGAG UGG AGC GCC UGU UCU AdTdT-3＇

反義鏈:5＇-pUAG AAC AGG CGC UCC ACU CdTdT-3＇

NC(Negative control)

正義鏈:5＇-pUUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT-3＇

反義鏈:5＇-pACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT-3＇

Negative control序列經(jīng)Blast確認與大鼠CTGFmRNA無同源性。

CTGF siRNA轉染L-02:將siCTGF Oligo和lipofectamine2000稀釋物混和，室溫孵育 20 min。滴入待轉染細胞孔，提取蛋白。加全蛋白裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心5 min收集上清液?？偟鞍讟悠泛?X SDS上樣緩沖液混勻后，100℃沸水煮5min。電泳分離，5%脫脂奶粉/TBST室溫，封閉60min;一抗4℃孵育過夜;TBS-T漂洗3次，每次10 min;二抗室溫孵育120 min;TBS-T漂洗3次，每次10 min。ECL(electrochemiluminescence)作用后膠片曝光，經(jīng)顯影、定影處理后觀察結果。結果以培清凝膠成像儀器成像，SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照分析。

1.2.2 動物實驗

1.2.2.1 肝纖維化大鼠模型的建立 30只雄性SD大鼠，隨機分成5組，每組6只。模型組腹腔注射40%CCl4(CCl4與橄欖油按2∶3比例混合，3 ml/kg)及尾靜脈注射生理鹽水(與siRNA溶液等量)，1次/3 d，連續(xù)8周，CCl4首劑加倍。預防組腹腔注射40%CCl4(3 ml/kg)及尾靜脈注射抗CTGF siRNA(0.1 mg/kg，溶于300 μl Opti-MEM1)，1 次/3 d，連續(xù) 8 周。2 周治療組腹腔注射40%CCl4(3 ml/kg)2周，后給予抗CTGF siRNA及CCl46周。4周治療組腹腔注射40%CCl4(3 ml/kg)4周，后給予抗CTGF siRNA及CCl44周?？瞻讓φ战M尾靜脈注射生理鹽水8周。以上各實驗組所用試劑計量及時間均參考國內(nèi)外文獻［5］。于最后一次CCl4注射3天后所有動物經(jīng)股動脈取血及肝組織標本。

1.2.2.2 肝纖維化(透明質(zhì)酸 HA、人Ⅲ型前膠原h(huán)pcIII及Ⅳ型膠原 Ⅳ.C)指標測定 按照放射免疫試劑盒說明書由蘭州大學第一醫(yī)院核醫(yī)學科操作。

1.2.2.3 組織學檢查 肝組織標本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。肝組織切片用于Masson染色，光鏡下觀察肝細胞變性、壞死、炎癥細胞浸潤及肝纖維化情況并拍照。參照慢性肝炎分級分期標準對大鼠肝纖維化程度進行病理分級。

1.2.2.4 RNA抽提及RT-PCR分析 提取肝組織總RNA，取總RNA溶于10μl反應體系行逆轉錄合成cDNA，在Rotor Gene-3000熒光定量PCR上進行PCR反應。PCR引物:CTGF sense:5＇-CAC CCG GGT TAC CAA TGA CAA-3＇;Anti-sense:5＇-AGC CCG GTA GGT CTT CAC ACT G-3＇;β-actin sense:5＇-GAC TCA TCG TAC TGC TTG CT-3＇;Anti-sense:5＇-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3＇。反應條件如下:第一步是預變性，95℃預變性30 s，共1個循環(huán);第二步是 PCR反應，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。整個過程中收集熒光，反應結束后，使用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值。

1.2.2.5 蛋白質(zhì)抽提及Western印跡分析取大鼠肝臟組織，裂解充分研磨，凝膠電泳分離，5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉60 min;一抗4℃ 孵育過夜;TBST(Tween-20 500 μl，10XTBS 50 ml，ddH2O 450 ml)漂洗3 次，每次 10 min;二抗室溫孵育 120 min，TBST漂洗3次，每次10 min。ECL作用后膠片曝光，經(jīng)顯影、定影處理后觀察結果。結果以培清凝膠成像儀器成像，SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照分析。

2 結果

2.1 通過細胞轉染篩選高效的CTGF siRNA

2.1.1 3條CTGFsiRNA分別轉染L-02細胞CTGF蛋白表達的干擾效果 Western Blot結果經(jīng)計算機灰度掃描并與內(nèi)參(β-actin)比較分析顯示。L-02細胞轉染 siCTGF-1、siCTGF-2、siCTGF-3干擾后，CTGF蛋白表達分別為55.09±2.34、6.18 ±0.32、18.66 ±1.09，與對照相比，轉染siRNA的L-02細胞CTGF蛋白表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 L-02細胞CTGF蛋白表達Fig.1 L-02 CTGF cell protein expression

2.1.2 篩選高效的CTGFsiRNA序列 將control(空白對照)組比值數(shù)據(jù)看做100%，分別得到 siCTGF-1、siCTGF-2、siCTGF-3各片段，干擾率為44.91%、93.99%、81.34%，其中以siCTGF-2干擾率最高，效果最明顯。轉染非特異性siRNA的L-02細胞CTGF蛋白表達無明顯變化(P＜0.05)。見圖2。

2.2 CTGF siRNA對大鼠肝纖維化的影響

圖2 各siRNA片段對L-02細胞CTGF蛋白表達的影響Fig.2 SiRNA on to L-02 CTGF cell protein expression effect

2.2.1 顯著減輕肝細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤及肝纖維化程度 Masson染色所見，纖維沉積基本為膠原纖維，顯色為綠色。正常組(圖3a)肝小葉結構正常。模型組(圖3b)肝小葉結構失常，肝細胞重度壞死，嗜酸性變，細胞間質(zhì)纖維組織增生，大量炎性細胞浸潤;根據(jù)評分標準炎癥活動度(G)為4級，肝纖維化程度(S)為3級。而預防組(圖3c)G為0～1級，S為0～1級，治療組(圖3d)G為1級，S為1級，均肝細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤明顯減輕。晚期治療組(圖3e)肝小葉結構存在，肝細胞輕度變性壞死，伴橋接壞死，匯管區(qū)少量纖維組織增生，少量淋巴細胞浸潤，根據(jù)評分標準G為1～2級，S為2級。

2.2.2 CTGF siRNA對肝組織纖維化的影響顯著減少血清中HA、hpcⅢ及Ⅳ.C含量(見表1)。

2.2.3 CTGF siRNA對肝組織CTGF基因表達的影響

2.2.3.1 顯著抑制CTGF mRNA表達 見表2。分別擴增 CTGF和 β-actin，每樣本重復3次，得到 Ct 平均值?！鰿t干預組=Ct干預組CTGFCt干預組β-actin，△Ct空白組= Ct空白組CTGF-Ct空白組β-actin，△△Ct= △Ct干預組—△Ct空白組，CTGFmRNA 表達差別倍數(shù)以 2-△△Ct表示。

2.2.3.2 顯著抑制CTGF蛋白表達(見圖4)

Western印跡結果與內(nèi)參照(β-actin)比較分析顯示，CTGF/β-actin灰度比在預防組(0.105±0.003)、治療組(0.190 ±0.006)、晚期治療組(0.334±0.006)較模型組(0.544±0.019)明顯減低(P ＜0.05)，對照組為0.027±0.003，表明靜脈注射抗CTGF siRNA在蛋白質(zhì)水平可顯著抑制CCl4誘導的大鼠肝CTGF基因表達。

圖3 大鼠肝細胞切片圖(×200)Fig.3 Rat liver cells slice figure(×200)

表1 抗CTGF siRNA對大鼠肝纖維化各項指標的影響(±s)Table 1 CTGF siRNA in rat liver fibrosis the effect of the indicators

表1 抗CTGF siRNA對大鼠肝纖維化各項指標的影響(±s)Table 1 CTGF siRNA in rat liver fibrosis the effect of the indicators

a與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);b與4周治療組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

組 別 例數(shù) HA(ng/ml) hpcⅢ(μg/l) IV-C(ng/ml)空白對照組 6 39.12±6.42a 62.55±11.77a 27.50±16.33a模型組 6 376.67±41.49 517.10±80.3 247.87±24.59預防組 6 181.25 ±20.06a，b 196.52 ±16.77a，b 148.47 ±11.05a，b 2 周治療組 6 217.83 ±17.74a，b 242.87 ±17.49a，b 181.68 ±12.18a，b 4周治療組 6 285.17±15.64a 317.43±18.76a 214.52±11.13a F值 170.93 112.06 170.52 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達相對值比較Table 2 Each rat liver tissue CTGF gene expression compared the relative value

圖4 肝組織CTGF蛋白表達Fig.4 CTGF liver tissue protein expression

3 討論

肝纖維化是所有慢性肝病進展為肝硬化必然的中間過程，是肝臟對各種慢性損傷刺激的一種修復反應，主要與HSC及各種促纖維化細胞因子有關，目前尚無有效的防治方法［6-7］，故積極探索肝纖維化的發(fā)病機制及尋找有效的抗肝纖維化的方法是減少慢性肝炎患者死亡率的關鍵，已成為人們研究的熱點。CTGF是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種在肝纖維化過程中起關鍵作用的細胞因子，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關，被認為是RNAi治療肝纖維化較理想的靶位，倍受關注［8］。

本實驗設計的三段CTGFsiRNA片段對靶基因表達均有明顯的抑制作用，但抑制效率并不完全相同，以siCTGF-2抑制效率最高，且達90%以上，可以高效抑制靶基因表達，成功篩選出高效CTGFsiRNA。各種病因所致的肝臟慢性的炎癥、缺血及壞死，可以通過刺激局部肝細胞、HSC、內(nèi)皮細胞及炎癥浸潤細胞釋放出各種細胞因子，而這些細胞因子則參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的過程。近年來許多文獻報道，抑制CTGF的表達能夠明顯減輕大鼠肝細胞變性、壞死及炎癥細胞的浸潤，使膠原增生明顯減少，肝纖維化明顯減輕，正如本實驗研究中肝組織病理改變所見，提示CTGF可能具有促進炎癥或化學趨化的作用。抑制CTGF能夠保護肝臟細胞免受細胞毒的刺激損傷的機制目前尚不清楚，有待更進一步的研究。

通過大鼠尾靜脈注射CTGFsiRNA進一步證實，干預大鼠肝臟CTGF基因表達，可顯著抑制CCl4誘導的肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，表現(xiàn)為肝細胞外基質(zhì)合成及分泌減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原及層黏連蛋白是ECM的主要組份，但透明質(zhì)酸(HA)及Ⅲ型前膠原(hpcⅢ)是反映肝纖維化發(fā)生發(fā)展動態(tài)變化最靈敏的兩種ECM成分［9］。本實驗研究結果顯示，沉默CTGF表達對CCl4介導的肝纖維大鼠外周血HA及Ⅲ型前膠原的含量有明顯減少，而空白對照組大鼠上述參數(shù)無明顯差異。

肝內(nèi)的CTGF主要是由活化的HSC和(或)增殖的膽管上皮細胞產(chǎn)生，siRNA的沉默時間將因為細胞的增殖分裂而縮短。因此，要在體內(nèi)持久(4～6周)沉默肝臟內(nèi)CTGF的表達，則必須反復給藥，這對于經(jīng)門靜脈注射siRNA來說將難以操作，因為反復經(jīng)門靜脈給藥會將感染的幾率加大［5］。本研究結果顯示:經(jīng)尾靜脈注射siRNA不僅可以有效的抑制靶基因表達，而且可以反復給藥，最終達到持續(xù)抑制的效果。

但是，體外合成的siRNA轉染細胞后干擾效能只能維持短短幾天，因此，我們將在后續(xù)實驗中利用質(zhì)粒構建所篩選出的高效的siCTGF-2特異性載體，以延長其干擾作用的持續(xù)時間。此外，如何選擇準確的方法使合成siRNA更加省時且經(jīng)濟有效;如何有效輸送siRNA到達靶位及確保siRNA在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達等問題，都有待于人們研究解決。近年來這些疑惑正被逐步探索。我們相信在不久的將來，RNAi技術在有效抗肝纖維化治療中將發(fā)揮其巨大作用，造福于人類健康。

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