魯 兗，邢小康，宋廣忠，陳 智

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310003;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310009)

丙型肝炎病毒(HCV)是引起肝臟病變和誘發(fā)肝癌的主要病原體之一，它極易變異，因此研制疫苗難度很大。而且其治療方法有限，目前主要采用干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的方法，但部分患者效果不甚理想。因此，探尋HCV在感染后是通過哪些方式復(fù)制的以及干擾素對(duì)HCV是如何作用的，就顯得越來越重要了。

mi-RNA是一類長約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，自1993年第一個(gè)mi-RNA編碼基因lin-4由Lee等在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)以來，迄今為止結(jié)合基因克隆和各種生物信息學(xué)方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5000余種mi-RNA，其中包括500余種人mi-RNA，它們?cè)谌祟惖幕虮磉_(dá)上扮演著重要的角色［1］。一旦mi-RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控出了問題，就有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近來，許多研究表明mi-RNA參與多種病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)，有些宿主和病毒都可以編碼mi-RNA，并且兩者都在調(diào)控病毒生存周期及病毒與宿主相互作用的過程中起到非常關(guān)鍵的作用。

目前已有報(bào)道，mi-RNA122可以與HCV基因組相互作用調(diào)節(jié)HCV的表達(dá)，當(dāng)mi-RNA122被滅活，HCV復(fù)制水平明顯降低［2］。那么，是不是有更多的mi-RNA可能與HCV的復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)?干擾素究竟能在什么層面上對(duì)病毒發(fā)揮作用?為此，我們做了以下實(shí)驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)，希望能篩選出與HCV感染和干擾素治療有關(guān)的mi-RNA。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 Huh7.5.1細(xì)胞來自美國斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由上海巴斯德研究所鐘勁教授提供。質(zhì)粒pFL-JC1由美國Apath公司惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑Trizol Reagent購于Invitrogen公司;T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒購于Takara公司;IFNα-2b購于PBL(Pestka Biomedical Laboratories)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 把Huh-7.5.1細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基中添加100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素。

1.2.2 HCV感染細(xì)胞模型的建立及驗(yàn)證pFL-J6JFH-1質(zhì)粒用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到HCV RNA轉(zhuǎn)錄體。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種Huh-7.5.1細(xì)胞，每孔中加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到60%～70%匯合度時(shí)，把HCV RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)去。轉(zhuǎn)染時(shí)，以每孔 2 μg HCV RNA 用 250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，再以每孔5 μl脂質(zhì)體用250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，并室溫放置5 min，將稀釋后的HCV RNA與脂質(zhì)體輕輕混合，室溫孵育20 min以形成復(fù)合物。然后每孔加入500 μl RNA-Lipofectamine復(fù)合物，輕搖混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。6 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第3天，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)基。把Huh-7.5.1細(xì)胞重新接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞達(dá)50% ～60%融合度時(shí)，每孔加入2 ml收集的細(xì)胞上清，培養(yǎng)箱中孵育4 h后用PBS清洗3次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

孵育后第3天，用Trizol提取感染細(xì)胞內(nèi)總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒操作說明對(duì)細(xì)胞內(nèi)HCV RNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用正常Huh-7.5.1細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.3 IFN處理HCV感染細(xì)胞 IFNα-2b以1 000 IU/ml處理上述HCV感染細(xì)胞，48 h后再次利用熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平。同時(shí)用未經(jīng)任何處理的感染細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.4 microRNA表達(dá)譜分析 用384孔TaqMan Low Density Array(A板)分析3組樣本的microRNA表達(dá)譜(參照試劑說明書)。方法為:配制PCR反應(yīng)液 在1.5 ml離心管里依次加入 TaqMan Universal PCR Master Mix 450 μl，RT 產(chǎn)物 6 μl，無核酶水 444 μl(共計(jì) 900 μl);上樣 將 100 μl PCR反應(yīng)液加入到 TaqMan MicroRNA Array的各自通道(共8道)，離心后封口。啟動(dòng)SDS v2.2程序運(yùn)行384孔TaqMan Low Density Array默認(rèn)的熱循環(huán)條件，分析microRNA表達(dá)譜(A板)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用2(-ΔΔCT)法分析組間microRNA的表達(dá)情況，篩選出差異表達(dá)的microRNAs。

2 結(jié)果

2.1 HCV感染細(xì)胞模型的建立 結(jié)果見圖1。在感染的Huh-7.5.1細(xì)胞中成功地檢測到了HCV RNA，而正常細(xì)胞組則無HCV RNA擴(kuò)增。內(nèi)標(biāo)基因GAPDH的擴(kuò)增曲線說明了樣品均一性較好。

圖1 感染細(xì)胞中HCV RNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 FQ-PCR amplification curve of HCV RNA in infected cell lines

2.2 microRNA表達(dá)譜分析本研究結(jié)果 分為Huh7.5.1細(xì)胞對(duì)照組，HCV感染組和感染后干擾素治療組，經(jīng)篩選的microRNA表達(dá)譜見表1。

3 討論

本研究分為Huh7.5.1細(xì)胞對(duì)照組、HCV感染組和感染后干擾素治療組。通過miRNA芯片對(duì)已知的380個(gè)mi-RNA進(jìn)行了檢測，許多mi-RNA發(fā)生了變化。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)其中有13種mi-RNA在HCV感染后表達(dá)上調(diào)，而在干擾素治療后則出現(xiàn)下調(diào)，另外還有7種mi-RNA則在HCV感染后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，而在干擾素治療后則發(fā)生上調(diào)(見表1)。因此，這些變化的mi-RNA很可能與HCV病毒的感染和清除過程有一定的相關(guān)性，即它們的表達(dá)差異或許是因?yàn)椴《镜母腥竞颓宄粍?dòng)發(fā)生改變，亦或者是它們的表達(dá)水平變化在HCV的病毒感染和干擾素清除病毒的過程中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。鑒于此，我們結(jié)合已報(bào)道的文獻(xiàn)，在發(fā)生以上改變的mi-RNA中選取一些進(jìn)行分析，推測它們與病毒的感染和清除可能存在著的聯(lián)系。

表1 經(jīng)篩選的microRNA表達(dá)譜Table 1 Expression profiling of screened microRNAs

Varnbolt等研究發(fā)現(xiàn)，在HCV感染合并肝癌患者中miR-10a均出現(xiàn)異常表達(dá)，比正常水平上調(diào)2倍［3］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)，正常Huh7.5.1細(xì)胞經(jīng)HCV感染后，miR-10a表達(dá)增加，上調(diào)至正常細(xì)胞的1.5倍，經(jīng)干擾素作用后，miR-10a表達(dá)下降至正常細(xì)胞的一半。miR-10a位于染色體17q21，其直接作用位點(diǎn)是HOXA1。它的異常表達(dá)很可能是HCV導(dǎo)致肝癌的因素之一，具體機(jī)理目前尚未研究清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

mi-RNA21在細(xì)胞中有多個(gè)靶基因，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中都起了重要的作用。它其中的一個(gè)作用位點(diǎn)在NFIB(nuclear factor I/B)上，NFIB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，mi-RNA21能夠抑制它的表達(dá)。結(jié)果中mi-RNA21的低表達(dá)會(huì)使NFIB蛋白高表達(dá)，可能與HCV病毒侵入導(dǎo)致宿主需要抑制它的轉(zhuǎn)錄有關(guān)［4-5］。同時(shí)在Marquez等的研究中發(fā)現(xiàn)，在慢性HCV感染的肝細(xì)胞中，SMAD7是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制信號(hào)蛋白，有抑制肝纖維化的作用［6］。mi-RNA21的上調(diào)可通過抑制SMAD7來促進(jìn)肝纖維化，而在我們的結(jié)果中，HCV感染后 mi-RNA21是下調(diào)的，而干擾素作用后卻出現(xiàn)mi-RNA21上調(diào)。這一相反的現(xiàn)象值得我們進(jìn)一步去研究其原因，是否mi-RNA21還針對(duì)其它信號(hào)通路，而該通路與HCV的感染和清除相關(guān)［7］。

mi-RNA149作用于 HIV病毒中的vpr基因，而vpr基因表達(dá)的vpr蛋白與反式激活病毒轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移病毒整合復(fù)合物的細(xì)胞核的一系列病毒生存的關(guān)鍵步驟有關(guān)。mi-RNA149高表達(dá)能抑制vpr蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。在HIV病毒中存在hiv1-mir-H1，能夠下調(diào)mi-RNA149的表達(dá)，從而促進(jìn)HIV病毒的感染。在HCV中也許沒有這種限制基因的存在，因此宿主細(xì)胞的mi-RNA149可能出于一種自我保護(hù)的機(jī)制呈現(xiàn)高表達(dá)，以對(duì)抗HCV病毒的入侵。干擾素作用后，但mi-RNA149卻幾乎消失。它與干擾素的作用關(guān)系需要進(jìn)一步去發(fā)掘［8］。

mi-RNA152，有報(bào)道表明其過度表達(dá)會(huì)使HLA-G蛋白表達(dá)顯著降低，HLA—G是非經(jīng)典性人類白細(xì)胞抗原I類基因，主要分布在母體胎兒界面絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層，可抑制NK細(xì)胞及T細(xì)胞殺傷活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)胎兒免受母體NK細(xì)胞及T細(xì)胞殺傷，在母胎免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［9］。本實(shí)驗(yàn)中HCV感染后mi-RNA152呈現(xiàn)低表達(dá)，會(huì)否引起HLA-G蛋白上調(diào)以逃避宿主對(duì)感染HCV細(xì)胞的免疫殺傷作用。而干擾素作用后，它大幅上升，預(yù)示著機(jī)體對(duì)HCV感染細(xì)胞的免疫耐受的打破，從而更有效地殺傷感染細(xì)胞和清除HCV。

慢性HCV感染的機(jī)制尚不明確，但有間接證據(jù)表明，HCV感染會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體有一定的損傷，并會(huì)引起一定程度的氧化應(yīng)激。這一過程可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一定程度的缺氧，而缺氧能夠觸發(fā) mi-RNA210的表達(dá)［10-11］。因此，mi-RNA210可能在病毒感染過程中一定程度地緩解其造成的缺氧狀況，這或許是機(jī)體自我保護(hù)的一種措施，但也可能是造成HCV感染慢性化的可能性原因之一。

目前，在病毒的感染、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及治療等眾多方面，mi-RNA已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，且被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控因素之一。以上僅僅是我們結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出的一些初步分析，表1中其余的 mi-RNA未能找到與HCV及干擾素治療相關(guān)的文獻(xiàn)及報(bào)道，這些mi-RNA或許與HCV的感染與清除無關(guān)，也可能還有新的作用機(jī)制等待我們?nèi)グl(fā)掘。因此下一步，我們將進(jìn)一步結(jié)合文獻(xiàn)選擇其中與HCV可能相關(guān)性大的mi-RNA，對(duì)其進(jìn)行人為的調(diào)控，觀察HCV感染與清除的變化，以期對(duì)靶點(diǎn)和機(jī)制進(jìn)行更深入的探究，同時(shí)結(jié)合臨床HCV難治型病例，發(fā)現(xiàn)與干擾素治療無效相關(guān)的可能機(jī)理，使mi-RNA在HCV治療領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

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