邢小康，何繼亮，陳 智

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310003;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)系，浙江杭州310058)

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染導(dǎo)致的全球傳染性疾病，也是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的主要原因之一。目前，聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療是丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但這種抗病毒療法僅僅對(duì)部分患者有較好療效，并且存在使用禁忌、個(gè)體差異和藥物副作用等問(wèn)題。因此，亟待開(kāi)發(fā)新的安全有效的替代療法。

RNA干擾是近些年來(lái)用于各種疾病干預(yù)的新的基因治療方法。在抗HCV方面，RNA干擾雖尚未應(yīng)用于臨床，但在實(shí)驗(yàn)室研究中已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展［1-3］，研究主要集中在含有HCV全長(zhǎng)或亞基因組復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型中進(jìn)行，而對(duì)于在HCV病毒顆粒感染的細(xì)胞中能否有效抑制HCV復(fù)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建HCV感染細(xì)胞模型，研究靶向 HCV NS5B基因的siRNA能否有效抑制HCV復(fù)制，通過(guò)檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)PKR基因的激活作用，進(jìn)一步探討病毒抑制是否通過(guò)PKR介導(dǎo)的固有免疫途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒 HCV全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒pFL-JC1由美國(guó)Apath公司惠贈(zèng)，Huh7.5.1細(xì)胞源自美國(guó)斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由上海巴斯德研究所鐘勁教授提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司;T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Promega公司;限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、綠豆核酸酶、蛋白酶K購(gòu)自NEB公司;RNA純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;HCV核心蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Meridian Life Science公司;FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Takara公司;IFNα-2b購(gòu)于PBL(Pestka Biomedical Laboratories)公司;siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成;熒光定量PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))、熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司生產(chǎn))、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Huh-7.5.1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素。

1.2.2 HCV RNA轉(zhuǎn)錄體的制備 取15 μg pFL-J6JFH-1質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)，37℃孵育2 h，之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否完全線性化。將酶切產(chǎn)物用綠豆核酸酶和蛋白酶K消化處理，然后用酚氯仿法抽提純化 DNA，最后用12 μl H2O溶解 DNA，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并定量。然后取2 μg DNA模板，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。得到的RNA轉(zhuǎn)錄體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)定濃度。

1.2.3 HCV感染細(xì)胞模型的建立 轉(zhuǎn)染前1天用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60% ～70%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，以每孔4 μg HCV RNA用250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，再以每孔5 μl脂質(zhì)體用250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋并室溫放置5 min，將稀釋后的HCV RNA與脂質(zhì)體輕輕混合，室溫孵育20 min。然后每孔加入500 μl RNA-Lipofectamine復(fù)合物，輕搖混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。6 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第3天，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)基，1 500 g離心5 min去除細(xì)胞碎片，置于-70℃保存。重新種植Huh-7.5.1細(xì)胞于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)50% ～60%融合度時(shí)，每孔加入2 ml收集的細(xì)胞上清，培養(yǎng)箱中孵育6 h后用PBS清洗3次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 間接免疫熒光檢測(cè)感染細(xì)胞中HCV核心蛋白的表達(dá) 用HCV感染細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，取出爬片放入12孔板中，用PBS洗3次后加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min。棄去固定液，PBS洗3次。然后加入含10%FBS的PBS室溫封閉 30 min。PBS洗 2次后用含0.1%Triton X-100封閉液稀釋(1∶200)的一抗37℃孵育2 h，用PBS洗3次，加入二抗稀釋液(1∶500)，37℃避光孵育1 h，再用PBS避光洗4～5次。用甘油-PBS封片，立即在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 siRNA的設(shè)計(jì) 利用ABI在線設(shè)計(jì)程序，針對(duì) HCV NS5B序列初步搜索出多條siRNA 序列，然后根據(jù) Reynolds［4］提出的理性設(shè)計(jì)原則篩選得出最終的siRNA序列，委托廣州銳博公司進(jìn)行化學(xué)合成。siRNA序列如下:

1.2.6 RNA干擾試驗(yàn) 待感染細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收集各孔細(xì)胞并混勻，接種于24孔板，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA。設(shè)9個(gè)NS5B siRNA組(濃度為4、40 和200 nmol/L，作用時(shí)間為 24 h、48 h 和72 h)，并于三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照、無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)組。轉(zhuǎn)染方法同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 siRNA對(duì)PKR基因激活試驗(yàn) siRNA轉(zhuǎn)染正常Huh-7.5.1細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組、3個(gè)siRNA 組(4、40和 200 nmol/L siRNA)和1 000 IU/ml IFNα-2b處理組。轉(zhuǎn)染方法同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 總RNA提取及cDNA合成 胰酶消化后用1.5 ml離心管收集細(xì)胞，PBS離心清洗3次。每管加入500 μl Trizol，按照操作說(shuō)明提取總RNA，最后用30 μl DEPC水溶解 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。取4 μl RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明先去除基因組DNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl。

1.2.9 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCV RNA及PKR mRNA相對(duì)量 分別加入10 μl SYBR Ex Taq 酶、0.4 μl ROX 參比染料、0.4 μl上下游引物、6.8 μl H2O 和 2 μl cDNA 模板配成PCR 20 μl反應(yīng)體系，于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。用于檢測(cè)HCV的引物位于HCV 5＇UTR，上游序列:5＇-GCGTTAGTATGAGTGTCG TG-3＇，下游序列:5＇-TCGCAAGCACCCTATCAG-3＇;內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)擴(kuò)增引物，上游:5＇-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3＇，下 游:5＇-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇;PKR 擴(kuò)增引物，上游:5＇-TCTACGCTTTGGGG CTAA-3＇，下 游:5＇-GCCATCCCGTAGGTCTGT-3＇。擴(kuò)增條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。所有樣品目的基因相對(duì)表達(dá)水平經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因GAPDH均一化處理后計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 HCV感染模型的建立 結(jié)果見(jiàn)圖1。用間接免疫熒光試驗(yàn)可檢測(cè)出HCV核心蛋白在被感染的Huh-7.5.1細(xì)胞中表達(dá)，但正常Huh-7.5.1細(xì)胞未檢測(cè)出HCV核心蛋白的表達(dá)。

圖1 被感染的Huh-7.5.1細(xì)胞中HCV核心蛋白免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.1 HCV core protein expression in infected(lane1)and normal(lane2)Huh-7.5.1 cells detected by indirect immunofluorescence

2.2 siRNAs對(duì)感染細(xì)胞中HCV復(fù)制的抑制作用檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖2。脂質(zhì)體組和無(wú)關(guān)siRNA組與對(duì)照組相比，HCV RNA水平均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。24 h時(shí)，40 nmol/L與200 nmol/L siRNA組HCV RNA水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。48 h時(shí)，3個(gè) siRNA組 HCV RNA水平與對(duì)照組相比均明顯下降(P＜0.01)。72 h時(shí)3個(gè)siRNA組HCV RNA水平與對(duì)照組相比也均明顯下降(P＜0.01)。3個(gè)濃度siRNA組之間均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。48 h、72 h 3個(gè)siRNA組HCV RNA水平與相應(yīng)的24 h組相比均顯著下降(P＜0.01)。

2.3 IFNα-2b對(duì)感染細(xì)胞中HCV的抑制作用的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖3。1 000 IU/ml的IFN作用24 h HCV RNA水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，48 h與72 h時(shí)HCV RNA水平與對(duì)照組相比差異非常顯著(P＜0.01)。48 h和72 h組與24 h組相比，HCV RNA水平下降更為明顯(P＜0.05)。

2.4 siRNA對(duì)PKR的激活作用的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，3種濃度的NS5B siRNA所誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)PKR mRNA水平無(wú)明顯差異，但I(xiàn)FN處理組明顯高于對(duì)照組和3個(gè)NS5B siRNA組(P＜0.01)。

3 討論

RNA干擾一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。長(zhǎng)的雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的一種Ⅲ型核糖核酸酶Dicer剪切為21～23 bp的小干擾RNA(siRNA)分子［5-6］，siRNA 繼而與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RISC)［7］，其中反義鏈與mRNA同源序列結(jié)合，以序列特異性方式導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的降解［8］。HCV 是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組RNA既可以作為復(fù)制模板又可以作為mRNA直接行使翻譯功能，另外，HCV主要定植于肝臟這個(gè)核酸分子和病毒載體的理想靶向器官，這些特點(diǎn)決定了HCV-RNA可以作為siRNA的有效靶分子［9］。

圖2 siRNAs對(duì)感染細(xì)胞中HCV復(fù)制的抑制作用檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Effect of NS5B siRNA on HCV RNA levels in infected Huh-7.5.1 cells

HCV復(fù)制子體外培養(yǎng)模型及感染模型的成功建立，對(duì)RNA干擾抑制HCV復(fù)制研究的發(fā)展發(fā)揮了巨大作用。目前，常用于構(gòu)建HCV體外培養(yǎng)模型的克隆體系是JFH1株，由Kato等從日本的一名爆發(fā)性肝炎患者的血清中克隆得到［10］。常用的培養(yǎng)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞株Huh-7及其衍生細(xì)胞系Huh-7.5和Huh-7.5.1。Huh-7細(xì)胞是目前公認(rèn)的可以支持HCV高水平復(fù)制的肝癌細(xì)胞株，Huh-7.5.1細(xì)胞是對(duì)含HCV復(fù)制子的 Huh-7.5細(xì)胞［11］用 IFNγ長(zhǎng)期處理獲得的［12］。Wakita等利用 HCV JFH1全基因組RNA轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，并證實(shí)了在此細(xì)胞中能夠進(jìn)行復(fù)制，但復(fù)制效率不高，產(chǎn)生的病毒顆粒感染性較低［13］。Lindenbach等構(gòu)建了HCV 2a JFH1與J6的嵌合株pFL-JC1，并證實(shí)了比JFH1株轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞具有更高的復(fù)制效率［14］。Zhong等則利用 JFH1 RNA轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞，產(chǎn)生了具有高感染活性的病毒顆粒［12］。本研究用pFL-JC1轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞后用上清孵育天然的Huh-7.5.1細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了天然Huh-7.5.1細(xì)胞成功被感染。由于HCV RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中病毒RNA的量過(guò)多(數(shù)據(jù)未顯示)，并不能模擬人體肝細(xì)胞真實(shí)被感染狀態(tài)。因此，我們欲將RNA干擾試驗(yàn)在HCV感染模型中進(jìn)行。

NS5B蛋白為RNA依賴的 RNA聚合酶(RdRp)，是催化 HCV RNA合成的關(guān)鍵酶。HCV復(fù)制是以HCV基因組正鏈RNA為模板合成負(fù)鏈RNA，再以負(fù)鏈RNA為模板合成子代正鏈RNA。正因?yàn)镽dRp對(duì)HCV復(fù)制的重要作用，NS5B不斷被選擇作為各種抗病毒治療的重要靶位。我們根據(jù)Elbashir等提出的設(shè)計(jì)規(guī)則［15］，結(jié)合 Reynolds提出的理性設(shè)計(jì)原則［4］，針對(duì)NS5B基因序列設(shè)計(jì)出siRNA序列并化學(xué)合成，采用與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的方式轉(zhuǎn)染被感染的Huh-7.5.1細(xì)胞。從總的結(jié)果來(lái)看，針對(duì)NS5B的siRNA可以有效抑制被感染的Huh-7.5.1細(xì)胞中的HCV復(fù)制。其中，40 nmol/L濃度的siRNA比4nmol濃度抑制率更高，而200 nmol/L濃度抑制效果相對(duì)40 nmol/L并沒(méi)有提高，提示抗HCV的siRNA在較低劑量時(shí)即具有很高的基因沉默效率。在siRNA作用時(shí)間上，可以看出RNA干擾發(fā)揮最大效應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)在48 h，而72 h時(shí)干擾效率得到了維持，這與IFN的作用相一致。

在哺乳動(dòng)物中，超過(guò)30 bp的雙鏈RNA就可能會(huì)產(chǎn)生干擾素反應(yīng)［16］。最初的研究認(rèn)為siRNA足夠短且足夠特異性而不會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，但是現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)顯示siRNA也可以激活固有免疫，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。PKR介導(dǎo)的干擾素反應(yīng)被認(rèn)為是機(jī)體抵御病毒感染的重要途徑。為了說(shuō)明本研究中siRNA導(dǎo)致的病毒抑制是相對(duì)特異性的，而并非通過(guò)激活PKR基因的表達(dá)，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞內(nèi)PKR mRNA的變化。結(jié)果顯示，3種濃度的siRNA均沒(méi)有導(dǎo)致PKR mRNA表達(dá)量上調(diào)，而對(duì)照組IFN則導(dǎo)致PKR mRNA明顯增加。但是，我們不清楚有無(wú)其他抗病毒蛋白被誘導(dǎo)而產(chǎn)生協(xié)助抑制病毒的作用。

盡管在感染細(xì)胞中，針對(duì)HCV NS5B的siRNA有效抑制了病毒復(fù)制，但靶向HCV其他基因區(qū)段的siRNA是否具有類似作用或更強(qiáng)的抑制效果還需要進(jìn)一步研究。本研究中，siRNA的最佳抑制效率并沒(méi)有達(dá)到IFN的藥效，考慮存在病毒逃逸可能。IFN的藥效顯示siRNA對(duì)病毒尚有進(jìn)一步的抑制空間，那么聯(lián)合應(yīng)用幾種針對(duì)HCV不同基因區(qū)段的siRNA是否可以應(yīng)對(duì)病毒逃逸策略而達(dá)到更好的抑制效率也需進(jìn)一步探索。在siRNA應(yīng)用于臨床治療之前，如何安全高效靶向運(yùn)送siRNA藥物仍然是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)，雖然目前可以在體外或體內(nèi)將siRNA通過(guò)病毒載體運(yùn)送至細(xì)胞，但病毒載體缺乏器官特異性，且在人體中的安全性也有待研究?？傊?，盡管目前siRNA抗HCV的臨床應(yīng)用還面臨諸多障礙，但隨著整個(gè)RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)HCV的深入認(rèn)識(shí)，相信在不久的將來(lái)，RNA干擾有望成為慢性丙型肝炎新的治療方法。

［1］KAPADIA S B， BRIDEAU-ANDERSEN A，CHISARI F V.Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4):2014-2018.

［2］YOKOTA T，SAKAMOTO N，ENOMOTO N，et al.Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived small interfering RNAs［J］.EMBO Rep，2003，4(6):602-608.

［3］SAKAMOTO N，TANABE Y，YOKOTA T，et al.Inhibition ofhepatitis C virus infection and expression in vitro and in vivo by recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23(9):1437-1447.

［4］REYNOLDS A，LEAKED，BOESEQ，etal.Rational siRNA design for RNA interference［J］.Nat Biotechnol，2004，22(3):326-330.

［5］ELBASHIR S M，HARBORTH J，LENDECKEL W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells ［J］.Nature，2001，411(6836):494-498.

［6］ELBASHIR S M，LENDECKEL W，TUSCHL T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs［J］.Genes Dev，2001，15(2):188-200.

［7］NYKANEN A，HALEY B，ZAMORE P D.ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway ［J］.Cell，2001，107(3):309-321.

［8］HAMMOND S M，BERNSTEIN E，BEACH D，et al.An RNA-directed nuclease mediates posttranscriptional gene silencing in Drosophila cells［J］.Nature，2000，404(6775):293-296.

［9］KHALIQ S，KHALIQ S A，ZAHUR M，et al.RNAi as a new therapeutic strategy against HCV ［J］.Biotechnol Adv，2010，28(1):27-34.

［10］KATO T，F(xiàn)URUSAKA A，MIYAMOTO M，et al.Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient［J］.J Med Virol，2001，64(3):334-339.

［11］BLIGHT K J，MCKEATING J A，RICE C M.Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication［J］.J Virol，2002，76(24):13001-13014.

［12］ZHONG J，GASTAMINZA P，CHENG G，et al.Robust hepatitis C virus infection in vitro［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(26):9294-9299.

［13］WAKITA T，PIETSCHMANN T，KATO T，et al.Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome ［J］.Nat Med，2005，11(7):791-796.

［14］LINDENBACH B D，EVANS M J，SYDER A J，et al.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture［J］.Science，2005，309(5734):623-626.

［15］ELBASHIR S M，HARBORTH J，WEBER K，et al.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs［J］.Methods，2002，26(2):199-213.

［16］PERSENGIEV S P，ZHUX，GREENMR.Nonspecific，concentration-dependentstimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs(siRNAs)［J］.RNA，2004，10(1):12-18.