劉滿華 田 蕾 郭連怡 李 舒 (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

凋亡是腫瘤發(fā)生的重要機制，凋亡通路的紊亂、促進凋亡因子的抑制、凋亡抑制因子的過表達以及凋亡基因的表達失控，都會導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Livin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，特異高表達于多種實體腫瘤組織和腫瘤細胞系，能抑制許多凋亡刺激誘發(fā)的細胞凋亡〔1〕。Caspase-9是一種促凋亡因子，屬于凋亡蛋白家族，是Caspase系統(tǒng)引起細胞凋亡的最關鍵成分之一。為探討兩者對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響，本實驗應用免疫組織化學方法檢測胃癌中Livin基因的表達及其與Caspase-9的關系，旨在探討二者在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，從而為胃癌的診斷與臨床治療提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2010年1月至2010年10月胃癌手術切除標本78例，其中男48例、女30例，年齡42～76歲，中位年齡64歲。所有患者均經(jīng)術中快速冷凍切片和常規(guī)病理診斷確診，術前均未接受化療、放療或免疫治療。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例，無Ⅳ期病例。組織學分級高分化3例，中分化22例，低分化33例，未分化20例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。隨機選取30例胃潰瘍患者胃黏膜組織作為對照。

1.2 試劑 Livin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)、Caspase-9兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)為武漢博士得生物工程有限公司產(chǎn)品，PV-6000免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自北京中杉金橋技術有限公司。

1.3 方法 采用免疫組織化學PV-6000兩步法。標本離體后迅速用10%甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)冷凍切片，二甲苯脫蠟至水，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復2 min后自然冷卻至室溫，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加生物素標記二抗(鼠抗兔IgG多聚體)37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 Livin可以表達于細胞質(zhì)和/或細胞核，Caspase-9表達于細胞質(zhì)。每張切片隨機選擇5個高倍視野，每個高倍鏡視野計數(shù)100個細胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強度和陽性細胞百分率判斷染色結(jié)果。按染色強度評分:無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;按陽性細胞百分率評分:無陽性細胞0分，陽性細胞百分率＜10%1分，10% ～49%2分，50% ～74%3分，75% ～100%4分。2項評分乘積≥3分為陽性，＜3分為陰性。結(jié)果判定采用雙盲法，由2名有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師認定。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，各組間率比較采用 χ2檢驗，兩指標陽性表達之間的關系采用Spearman等級相關性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Livin在胃癌組織及對照胃組織中的表達情況 在78例胃癌組織中有42例Livin蛋白表達陽性，14例Caspase-9表達陽性，而30例對照胃組織中僅有4例Livin蛋白表達，Caspase-9表達陽性為17例。Livin主要出現(xiàn)在腫瘤組織中，間質(zhì)細胞及臨近正常組織中不表達，見圖1，Caspase-9的表達主要位于胞質(zhì)，見圖1。Livin在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于對照組中的陽性表達率，而Caspase-9在胃癌組織中的陽性表達率明顯低于對照組中的陽性表達率，二者的差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見表1。

圖1 各組Livin及Caspase-9的表達(DAB，×400)

表1 Livin與Caspase-9在胃癌及對照胃組織中的表達(n)

2.2 Livin與Caspase-9在胃癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關系 Livin與Caspse-9蛋白的表達與性別、年齡、腫瘤大小均無相關性(P＞0.05)。Livin與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(P＜0.05)，隨著腫瘤浸潤深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和臨床分期的的提高而增加;與腫瘤的病理分化程度負相關，隨著腫瘤病理分化程度的提高而降低。而Caspase-9與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈負相關(P＜0.05)，隨著腫瘤浸潤深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和臨床分期的的提高而降低;與腫瘤的病理分化程度正相關，隨著腫瘤病理分化程度的提高而增加。見表2。

2.3 胃癌組織中Livin與Caspase-9表達的關系 42例Livin蛋白表達陽性的胃癌組織中有3例Caspase-9蛋白表達陽性，36例Livin蛋白表達陰性的胃癌中有11例Caspase-9表達陽性，Livin與Caspase-9的表達呈負相關(P＜0.01，r=－0.304)。

表2 Livin與Caspase-9在胃癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

凋亡或細胞程序性死亡是具有獨特形態(tài)學和生物學特征的細胞死亡的一種遺傳機制〔2〕。細胞凋亡是機體重要的生理過程，起著維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關鍵作用。近來一些研究表明，凋亡在腫瘤的發(fā)生中也扮演著重要的角色。

IAPs是近年來備受矚目的一類蛋白家族，其抑制凋亡的多樣性高于已發(fā)現(xiàn)的其他凋亡抑制因子家族。Livin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，N端僅包含一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列BIR結(jié)構，C端含一個RING環(huán)指結(jié)構。Livin的主要作用是抗細胞凋亡，目前的研究認為它主要通過其BIR區(qū)與Caspase結(jié)合啟動以阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑，從而抑制凋亡蛋白酶的活性。研究顯示Livin在很多人類惡性腫瘤中高表達，如黑色素瘤〔3〕、腎癌〔4〕、大腸癌〔5〕、非小細胞肺癌〔6〕、胃癌〔7〕等，提示該基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。本實驗結(jié)果表明，Livin在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于非胃癌組織，二者比較有顯著性差異(P＜0.01)。本文研究還發(fā)現(xiàn)，Livin蛋白在有淋巴轉(zhuǎn)移患者中陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.01)，提示Livin除抑制細胞凋亡之外還可能促進腫瘤細胞增殖。另外，Livin與腫瘤浸潤深度、臨床分期呈正相關，與腫瘤的病理分化程度呈負相關(P＜0.05)，隨著腫瘤病理分化程度的降低而增高，提示Livin蛋白的持續(xù)表達可能進一步參與胃癌的惡性演進過程，而且極有可能成為反映胃癌惡性程度的參考指標之一。

Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，多數(shù)Caspase正常以非活性的前體即Caspase酶原或Procaspase形式存在，在凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)其在凋亡調(diào)控中的不同作用，Caspase家族可以分為凋亡的啟動者和凋亡的執(zhí)行者〔8〕。Caspase-9是Caspase家族中最重要的起始因子〔9〕，屬于線粒體通路凋亡的啟動者，在這個通路中，細胞因為應激，細胞色素C從線粒體中釋放入細胞質(zhì)，與凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)以及Procaspase-9結(jié)合，形成凋亡復合體從而導致Caspase-9的活化，進而激活其下游的效應Caspase，如Caspase-3和Caspase-7，從而啟動細胞死亡程序。本實驗結(jié)果顯示:Caspase-9在胃癌組織中低表達，而在對照胃黏膜組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Caspase-9在腫瘤組織中表達下調(diào)的原因可能是:機體在致癌因素的作用下進行陰性克隆篩選，Caspase-9表達高的細胞促進腫瘤細胞凋亡，而表達較低水平的細胞則生存了下來。由此，我們可以認為Caspase-9是一種抑癌基因，與Soengas等〔10〕的觀點一致，且可能在胃癌的發(fā)病過程中扮演著重要的角色。經(jīng)統(tǒng)計學分析，Caspase-9在胃癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，提示Caspase-9活性可能在腫瘤細胞中受抑制，導致凋亡抑制，腫瘤細胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，Caspase-9陽性表達率與腫瘤浸潤深度、臨床分期呈負相關，與腫瘤的病理分化程度呈正相關(P＜0.05)，隨著腫瘤病理分化程度的增高而增高，低分化胃癌中Caspase-9的表達低于高中分化胃癌，提示低表達Caspase-9可使細胞凋亡減少，因而凋亡與增生失衡，使得癌細胞生長加快。因此，促進Caspase-9蛋白的激活或抑制其降解失活，促進腫瘤細胞凋亡，是抑制胃癌的有效方法。Caspase-9可能成為胃癌臨床診斷、判斷療效及監(jiān)測預后的可靠指標。

在本研究中，Livin和Caspase-9在胃癌組織中表達具有相關性，二者表達呈負相關(P＜0.01，r=－0.304)，表明Livin抑制細胞凋亡可能與其抑制Caspase-9有關，而且二者的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、臨床分期及病理分化程度有關，由此推測Livin可能通過某種信號傳導途徑抑制Caspase-9的活性，從而抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖，引起胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Kasof等〔11〕研究證明Livin可以和下游Caspase的活性形式Caspase-3和Caspase-7直接作用，Livin的BIR結(jié)構能夠與Caspase結(jié)合而抑制后者的功能。Livin也可以直接抑制Procaspase-9的活化過程，使無活性的Procaspase-9不能活化成有活性的Caspase-9，而且Livin也可以直接抑制活化的Caspase-9的功能從而發(fā)揮抗凋亡的作用〔12〕。

但胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因共同參與、相互綜合作用的結(jié)果，并且參與調(diào)控的基因蛋白形成網(wǎng)絡、相互影響，有哪些因素可以誘導Livin基因表達，其調(diào)節(jié)過程與哪些信號傳導通路有關，Livin在抗凋亡中的作用以及調(diào)控Caspase-9基因的確切作用機制還有待進一步研究。

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12 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21):1359-66.