李建民 趙雅寧 張姍姍 陳長(zhǎng)香 馬素慧 李淑杏 (華北煤炭醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

如果β淀粉樣肽(Aβ)表達(dá)增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、損傷膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等神經(jīng)毒性作用〔1，2〕。參芎化瘀膠囊是由人參、地鱉蟲、川芎、乳香(制)、沒(méi)藥(制)、全蝎、紫河車、龍血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑葚子等多種成分組成的復(fù)方制劑，具有養(yǎng)血益氣、化瘀通絡(luò)等作用。以往研究表明川芎和郁金提純的單方生物制劑對(duì)腦缺血損傷有一定的治療作用〔3，4〕。本研究在大鼠全腦缺血再灌注損傷模型上，應(yīng)用不同劑量參芎化瘀膠囊進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)神經(jīng)功能及Aβ的影響，以探討復(fù)方制劑參芎化瘀膠囊對(duì)缺血性腦卒中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 參芎化瘀膠囊主要由人參、地鱉蟲、川芎、乳香(制)、沒(méi)藥(制)、全蝎、紫河車、龍血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑椹子等多種中藥成分組成的復(fù)方制劑，由華北煤炭醫(yī)學(xué)院研制，批號(hào):Z20051586。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SCXK(京)2005-0013，體重(270±25)g。隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，參芎化瘀膠囊高，低劑量組，每組10只大鼠。

1.3 儀器、試劑 圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad生物儀器設(shè)備公司);八臂迷宮(淮北正華);Aβ兔多抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);TUNEL試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔5〕制作SD大鼠全腦缺血模型。動(dòng)物常規(guī)麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在其下置線備用。枕后部正中切開，暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過(guò)的椎動(dòng)脈，電凝每次時(shí)間約2～4 s，使翼小孔后雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠，24 h后以無(wú)創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血30 min后松開動(dòng)脈夾，實(shí)行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)耳內(nèi)鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。假手術(shù)組分離暴露血管，但不電凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈。參芎化瘀膠囊于術(shù)前7 d每日經(jīng)胃灌注給藥給藥1次(低劑量2.4 g/kg，高劑量4.8 g/kg)，連續(xù)給藥7 d，第7天常規(guī)麻醉后制作腦缺血再灌注模型，術(shù)后繼續(xù)給藥2 d。

1.4.2 Aβ免疫組織化學(xué)檢測(cè) 標(biāo)本多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Aβ免疫組化染色(SABC法)。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。利用多媒體彩色病理分析系統(tǒng)計(jì)值，取均值。

1.4.3 TUNEL法 標(biāo)本多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取4張切片，每張切片在海馬隨機(jī)選取4個(gè)視野，在200倍光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4.4 學(xué)習(xí)和記憶功能檢測(cè) 應(yīng)用八臂迷宮學(xué)習(xí)和記憶行為功能檢測(cè)，每只動(dòng)物上下午各測(cè)試3次，每次間隔至少30 min，取均值。將大鼠放入迷宮內(nèi)，記數(shù)大鼠5 min內(nèi)搜索放置在八臂中的四個(gè)臂內(nèi)(1、3、5、7號(hào)臂)食物餌的規(guī)律:①總錯(cuò)誤次數(shù)，即沙鼠進(jìn)入沒(méi)有餌的臂(包括已吃完和未放餌的臂)的次數(shù);②工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)，指沙鼠再次進(jìn)入開始放有餌的臂;③參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)，指沙鼠第1次進(jìn)入沒(méi)有放餌的臂。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以表示，進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Aβ免疫組織化學(xué)結(jié)果 Aβ陽(yáng)性染色顯棕黃色。假手術(shù)組，可見(jiàn)少量Aβ陽(yáng)性細(xì)胞，染色淺淡;與假手術(shù)組比較，模型組中，Aβ陽(yáng)性細(xì)胞增多，染色棕黃(P＜0.05);與模型組比較，參芎化瘀膠囊組Aβ性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，染色更加深;且高劑量組更加明顯(P＜0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

2.2 海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化 與假手術(shù)組比較，模型組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P＜0.05);與模型組比參芎化瘀膠囊組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞減少，高劑量組中更為明顯(P＜0.05)，見(jiàn)圖 2、表 1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Aβ蛋白表達(dá)(DAB，×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞(TUNEL，×400)

表1 各組海馬區(qū)Aβ表達(dá)、凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(，n=10)

表1 各組海馬區(qū)Aβ表達(dá)、凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型組比較 :2)P＜0.05;與低劑量組比較:3)P＜0.05，下表同

18.52±2.21 3.17±2.00模型組 34.38±3.121) 33.45±3.481)低劑量參芎化瘀膠囊組 29.07±2.971)2) 22.58±2.271)2)高劑量參芎化瘀膠囊組 22.85±2.861)3) 17.47±1.841)3)凋亡神經(jīng)細(xì)胞假手術(shù)組組別 Aβ

2.3 學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)估 與假手術(shù)組比，模型組動(dòng)物連續(xù)6測(cè)試中總錯(cuò)誤次數(shù)、未進(jìn)入食物所在臂的錯(cuò)誤次數(shù)和重復(fù)進(jìn)入食物所在臂的錯(cuò)誤次數(shù)總均增加(均P＜0.05)，與模型組比較，參芎化瘀膠囊能顯著減少總錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.05)，但對(duì)工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)沒(méi)有影響(均P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠八臂迷宮測(cè)試結(jié)果(，n=10)

表2 各組大鼠八臂迷宮測(cè)試結(jié)果(，n=10)

工作記憶2.54±1.09 2.63±1.01 1.17±0.47模型組 8.84±3.781) 6.28±2.821)3.58±1.261)低劑量參芎化瘀膠囊組5.45±2.541)2)4.28±1.601)2)3.49±1.33高劑量參芎化瘀膠囊組3.12±1.801)3)2.10±1.001)3)錯(cuò)誤次數(shù)假手術(shù)組組別 總錯(cuò)誤次數(shù) 參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)3.35±1.58

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成缺血性腦卒中神經(jīng)功能缺失的關(guān)鍵因素之一，抑制或減少傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡已成為缺血性腦卒中救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。前期研究顯示，對(duì)前腦缺血再灌注沙鼠進(jìn)行缺血預(yù)處理，可抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善動(dòng)物的認(rèn)知功能情況〔6〕。王征等〔7〕報(bào)道含有三七、當(dāng)歸、丹參、銀杏葉等成分的腦脈泰可抑制缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。本研究結(jié)果說(shuō)明參芎化瘀膠囊對(duì)缺血性腦卒中起到了良好的治療效果。

研究表明缺血損傷后細(xì)胞毒性物質(zhì)增多，使軸漿運(yùn)輸失衡，導(dǎo)致APP積聚或突變，水解途徑趨向淀粉樣膚生成途徑，致使Aβ在細(xì)胞內(nèi)的異常增多增多Aβ主要表達(dá)在缺血梗死區(qū)周圍和膽堿能豐富的區(qū)域如海馬等腦功能重要區(qū)域，并與缺血面積與時(shí)程相關(guān)〔8，9〕;現(xiàn)已證Aβ具有介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、損傷膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)突觸、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等神經(jīng)毒性〔10〕。本研究結(jié)果顯示芎化瘀膠囊是通過(guò)有效拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用而改善腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的。

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