朱志圖 王 鍇 郁云龍 李恩澤 劉陽陽 哈敏文 劉云鵬

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121001)

胃癌是世界發(fā)病率列為第四的惡性腫瘤，雖然早期胃癌根治性手術后的5年生存率超過90%，但是晚期患者的預后較差，5年生存率不足10%〔1〕。在我國，大約2/3的患者確診時已屬晚期，不能手術切除，放化療是治療晚期胃癌的主要手段，但化療帶來的毒副反應一直是臨床難題。蟾蜍靈是中藥蟾酥的毒性配基之一，研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈具有抗腫瘤的作用〔2〕。奧沙利鉑廣泛用于結(jié)直腸癌，近年來發(fā)現(xiàn)對胃癌也具有較好療效。目前國內(nèi)外關于蟾蜍靈聯(lián)合其他化療藥治療胃癌的基礎研究較少，本實驗采用蟾蜍靈聯(lián)合奧沙利鉑作用于胃癌MGC803細胞，觀察兩藥聯(lián)合對胃癌細胞體外生長抑制及誘導凋亡作用，探討其作用機制，旨在為臨床化療方案的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑 胃癌MGC803細胞株由中國醫(yī)科大學腫瘤實驗室惠贈;蟾蜍靈購于Sigma公司，用無水乙醇配成0.01 mol/L貯存液，－20℃凍存，實驗時用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成所需濃度，乙醇終濃度＜0.01%，預實驗表明，該濃度乙醇對細胞增殖無影響;奧沙利鉑(50 mg/支)購于齊魯制藥有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清購于中國醫(yī)學科學院血液學研究所;碘化丙啶(PI)、噻唑藍(MTT)購于Sigma公司;Bax和Bcl-2單克隆抗體武漢博士德公司。

1.2 MTT法檢測蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥后細胞增殖抑制率 取處于對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，調(diào)整密度為3×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μl，實驗組加用不同濃度的單藥或聯(lián)合藥物，對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT液20 μl，到預定時間后加二甲基亞砜(DMSO)液200 μl，振蕩后酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測定各孔吸光度值。按細胞增殖抑制率計算公式計算細胞增殖抑制率，計算藥物抑制細胞增殖50%的濃度(IC50)及聯(lián)合指數(shù)。每組實驗重復3次。細胞增殖抑制率(%)=1－(實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.3 流式細胞術分析周期阻滯及凋亡百分率 分別收集對照組及處理組細胞，1 000 r/min離心5 min，冷 PBS洗滌，加入70%的冷乙醇4℃過夜，1 000 r/min再離心5 min，后加入終濃度為10 mg/ml的PI，避光反應30 min后進行流式細胞儀測定，采用Cell Quest進行細胞各期的百分比分析，判定凋亡細胞百分率。

1.4 Western印跡法檢測蛋白的表達 將對照組和處理組的細胞加RIPA裂解液在冰上裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，取上清，采用Lowry法進行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。取50 μg蛋白樣品在15%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠中電泳約3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上2 h。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入Bax抗體(1∶300)、Bcl-2(1∶300)抗體及β-actin抗體(1∶1 000)，過夜。Tris鹽水緩沖液(TTBS)洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶800)作用30 min，發(fā)光免疫分析(ECL)法顯色后GIS數(shù)碼系列凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析處理。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件進行分析，資料數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥對胃癌MGC803細胞的抑制作用 蟾蜍靈和奧沙利鉑單用或聯(lián)用均對MGC803生長有抑制作用，二者單用或聯(lián)用的抑制作用隨著藥物濃度和作用時間增加而增強，呈時間-劑量依賴方式，不同濃度、不同時間點之間抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，聯(lián)合用藥時IC50均較單藥低，聯(lián)合指數(shù)(CI)＜1，提示兩藥有協(xié)同作用。見表1，表2;圖1。

表1 藥物對MGC803細胞增殖抑制作用(，n=3)

表1 藥物對MGC803細胞增殖抑制作用(，n=3)

與對照組比較:1)P＜0.05;與單藥組比較:2)P＜0.05

1.022±0.043 1.033±0.029 1.116±0.034蟾蜍靈組(nmol/L)10 0.721±0.0361)0.722±0.0191)0.633±0.0311)20 0.662±0.0201)0.670±0.0151)0.501±0.0271)40 0.606±0.0451)0.564±0.0261)0.452±0.0361)80 0.561±0.0251)0.440±0.0841)0.297±0.0251)160 0.452±0.0491)0.321±0.0361)0.175±0.0531)奧沙利鉑組(μg/ml)2.5 0.734±0.0381)0.652±0.0181)0.488±0.0221)5.0 0.659±0.0321)0.613±0.0291)0.367±0.0181)10.0 0.611±0.0511)0.579±0.0241)0.283±0.0321)20.0 0.521±0.0221)0.496±0.0161)0.180±0.0131)40.0 0.475±0.0271)0.381±0.0231)0.174±0.0291)聯(lián)合組10/2.5 0.646±0.0341)2)0.567±0.0641)2)0.399±0.0431)2)20/5.0 0.591±0.0821)2)0.419±0.0211)2)0.280±0.0341)2)40/10.0 0.474±0.0151)2)0.336±0.0291)2)0.198±0.0261)2)80/20.0 0.402±0.0161)2)0.228±0.0141)2)0.184±0.0201)160/40.0 0.286±0.0471)2)0.143±0.0211)2)0.125±0.0171)24 h 48 h 72 h對照組組別

表2 各組IC50及CI值

2.2 蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合誘導MGC803細胞周期阻滯及凋亡 10 nmol/L蟾蜍靈、10 μg/ml奧沙利鉑及兩藥聯(lián)合分別作用細胞24 h后，流式細胞術檢測聯(lián)合組出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)，與對照組、單藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖1;表3。

表3 藥物作用細胞24 h周期分布(%)

2.3 蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合對凋亡蛋白Bax、Bcl-2蛋白的影響 蟾蜍靈、奧沙利鉑單藥作用于MGC803細胞24 h后，Western印跡結(jié)果顯示Bax及Bcl-2蛋白表達無明顯變化，而聯(lián)合組Bcl-2蛋白表達下降到對照組的57.14%，Bax蛋白表達上調(diào)至對照組的145.94%，Bax/Bcl-2比值增加到對照組的2.56倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 流式細胞術檢測藥物誘導細胞凋亡

圖2 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討論

蟾蜍靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥中蟾毒的主要成分，有強心、麻醉等作用，近年來國內(nèi)外學者研究證明蟾蜍靈可以抑制白血病細胞及實體瘤細胞〔3，4〕增殖并誘導其周期阻滯和凋亡。奧沙利鉑是一種新型的鉑類抗癌藥，治療晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌活性高且療效較好，但其神經(jīng)毒性等不良反應亦困擾臨床，有報道其慢性神經(jīng)毒性發(fā)生率為65% ～98%，急性神經(jīng)毒性可達100%〔5〕，且缺乏有效的預防和治療方法，已證實奧沙利鉑與氟尿嘧啶、順鉑、伊立替康等有協(xié)同增效作用〔6〕，但與蟾蜍靈聯(lián)合療效尚未見報道。

本文首次采用蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥作用于胃癌MGC803細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩藥單藥均可抑制細胞生長，呈時間劑量依賴效應。兩藥聯(lián)合組抑制率高于單藥組，計算24、48、72 h各組IC50得出的兩藥CI都小于1，顯示聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用?；贛TT結(jié)果，應用小劑量蟾蜍靈及奧沙利鉑作用細胞24 h，流式細胞術顯示兩單藥未引起明顯細胞凋亡，而小劑量聯(lián)合用藥可誘導細胞凋亡，與單藥組對比有統(tǒng)計學差異，同樣顯示兩藥有協(xié)同作用。

抗癌藥物作用腫瘤細胞在低濃度表現(xiàn)為周期抑制，高濃度時表現(xiàn)為細胞凋亡。蟾蜍靈作用細胞周期阻滯的報道不一，Li〔7〕發(fā)現(xiàn)20 nmol/L蟾蜍靈可引起胃癌細胞 G2/M期阻滯，80 nmol/L時誘導細胞凋亡。奧沙利鉑是作用于DNA化學結(jié)構(gòu)的細胞毒類藥物，研究發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑可引起胃癌細胞G0/G1、S期阻滯〔8，9〕，提示奧沙利鉑為細胞周期非特異性化療藥物。蟾蜍靈與奧沙利鉑抗癌作用機制及對細胞阻滯周期不同，符合聯(lián)合化療原則。本實驗奧沙利鉑組S期細胞增多，且聯(lián)合組出現(xiàn)明顯亞二倍體凋亡峰，提示兩藥可能通過使細胞停滯于S、G2/M期，當細胞DNA合成和有絲分裂均受阻時，細胞增殖受到抑制，細胞凋亡則會增加。

Bcl-2家族被認為是細胞凋亡基因家族中重要的調(diào)控基因，自1985年Tsujim等首次發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因至今已發(fā)現(xiàn)20種因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，分為三大類，其中包括Bax亞家族，Bax通過與Bcl-2形成同二聚體或異二聚體對細胞凋亡進行調(diào)節(jié)，二者的比例決定了細胞的凋亡，當Bax增多時，形成Bax-Bax同二聚體可使線粒體膜通透性增加，細胞色素C(Cyt-C)從線粒體釋放到胞漿增多，后者通過作用于凋亡蛋白激活因子-1，繼而激活凋亡蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，從而誘導細胞凋亡〔10〕，而當Bcl-2過量時，形成Bax-Bcl-2的異二聚體，可干擾線粒體膜通道的形成，維持線粒體外膜的完整性，阻止Cyt-C與半胱天冬氨酸激活蛋白(Smac)/低等電點凋亡抑制蛋白(IAP)結(jié)合蛋白(DIABIO)(Smac/DIABLO)的釋放，從而保護細胞免于凋亡〔11〕。蟾蜍靈和奧沙利鉑促凋亡的過程均由Bcl-2家族參與〔12，13〕，本研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈與奧沙利鉑聯(lián)合作用24 h后，Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下降，提示藥物可能通過上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2發(fā)揮促進細胞凋亡的作用，與學者Wang的報道相似〔14〕。本研究為臨床聯(lián)合用藥提供一些實驗依據(jù)，但具體用藥劑量、時間及先后順序和凋亡確切機制仍需進一步研究，其藥物療效、不良反應有待臨床驗證。

1 Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(1):17-20.

2 韓鴻彬，陳嘉勇.華蟾酥抗腫瘤作用及其機制的研究進展〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2005;12(2):160-2.

3 Huang C，Chen A，Guo M，et al.Membrane dielectric responses of bufalin-induced apoptosis in HL-60 cells detected by an electrorotation chip〔J〕.Biotechnol Lett，2007;29(9):1307-13.

4 Takai N，Ueda T，Nishida M，et al.Bufalin induces growth inhibition，cell cycle arrest and apoptosis in human endometrial and ovarian cancer cells〔J〕.Int J Mol Med，2008;21(5):637-43.

5 Kemeny N，Garay CA，Gurtler J，et al.Randomized multicenter phase Ⅱtrail of bolus plus infusional fluorouracil/leucovorin compared with fluorouracil/leucovorin plus oxaliplatin as third-line treatment of patients with advanced colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol，2004;22(23):4753-61.

6 白 樺，申維璽，李先明，等.紫杉醇或草酸鉑聯(lián)合氟脲嘧啶/亞葉酸治療晚期胃癌的對比研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2007;34(18):1039-40.

7 Li D，Qu X，Hou K，et al.PI3K/Akt is involved in bufalin-induced apoptosis in gastric cancer cells〔J〕.Anticancer Drugs，2009;20(1):59-64.

8 Tanaka R，Ariyama H，Qin B，et al.Synergistic interaction between oxaliplatin and SN-38 in human gastric cancer cell lines in vitro〔J〕.Oncol Rep，2005;14(3):683-8.

9 Qin B，Tanaka R，Shibata Y，et al.In-vitro schedule-dependent interaction between oxaliplatin and 5-fluorouracil in human gastric cancer celllines〔J〕.Anticancer Drugs，2006;17(4):445-53.

10 Sawa H，Kobayashi T，Mukai K，et al.Bax overexpression enhances cytochrome c release from mitochondria and sensitizes KATOIII gastric cancer cells to chemotherapeutic agent-induced apoptosis〔J〕.Int J Oncol，2000;16(4):745-9.

11 Donovan M，Cotter TG.Control of mitochondrial integrity by Bcl-2 family members and caspase-independent cell death〔J〕.Biochim Biophys Acta，2004;1644(2-3):133-47.

12 Watabe M，Kawazoe N，Masuda Y，et al.Bcl-2 protein inhibits bufalininduced apoptosis through inhibition of mitogen-activated protein kinase activation in human leukemia U937 cells〔J〕.Cancer Res，1997;57(15):3097-100.

13 Hayward RL，Macpherson JS，Cummings J，et al.Enhanced oxaliplatininduced apoptosis following antisense Bcl-xl down-regulation is p53 and Bax dependent:Genetic evidence for specificity of the antisense effect〔J〕.Mol Cancer Ther，2004;3(2):169-78.

14 Wang Z，Zhou J，F(xiàn)an J，et al.Oxaliplatin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth〔J〕.Expert Opin Investig Drugs，2009;18(11):1595-604.