劉雨娟 黃 征 藺美玲 張小郁 鄭天珍

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與心理學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

肥胖病的機(jī)制主要與人的氣血多少，痰濁以及淤血有關(guān)。芍藥能養(yǎng)血活血，柔肝止痛，斂陰收汗，屬于滋陰藥。芍藥苷是從芍藥中提取的最主要的生物活性成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為芍藥苷具有多種藥理活性，如解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及改善學(xué)習(xí)記憶的作用，還具有抗自由基損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗KA神經(jīng)毒性等多種生物學(xué)效果〔1〕。我們的前期工作已證明白芍水煎劑能顯著抑制去卵巢肥胖大鼠的體重和血清甘油三酯(TG)水平的升高，同時(shí)可以改善大鼠體內(nèi)脂代謝紊亂，清除過多的自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力。但其化學(xué)成分芍藥苷是否對(duì)脂肪組織有直接的影響，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)離體脂肪組織釋放游離脂肪酸(FFA)及抗氧化作用的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年SD大鼠，體重(250±20)g。由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物等級(jí)為清潔級(jí)。芍藥苷由陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司提供。異搏定為蘭州制藥廠產(chǎn)品。普萘洛爾(心得安)為北京第二制藥廠產(chǎn)品。AC抑制劑(SQ22，536)和小牛血清白蛋白(BSA)由Sigma公司提供。鹽酸腎上腺素為天津金耀氨基酸公司產(chǎn)品。丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)的試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法 將SD大鼠脫臼處死，迅速剪取腹膜后脂肪組織塊，每份(50±2.0)mg，放入37℃的含有0.04 g/ml小牛血清白蛋白的Krebs液中溫育。溫育液中可分別加入不同濃度的芍藥苷及不同的阻斷劑，加入的藥物容量均為20 μl。溫育過程中持續(xù)通入95%的O2和5%CO2的混合氣體。90 min后，吸取溫育液用一次提取比色法測(cè)定FFA的含量。用化學(xué)反應(yīng)法檢測(cè)MDA及T-AOC，檢測(cè)方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為8組，分別為:①正常對(duì)照組(0.9%NaCl);②鹽酸腎上腺素(10-6mol/L)組;③芍藥苷低劑量(10－7mol/L)組;④芍藥苷中劑量(10－6mol/L)組;⑤芍藥苷高劑量(10－5mol/L)組;⑥心得安(10－5mol/L)+芍藥苷(106mol/L)組;⑦ SQ22，536(10－5mol/L)+ 芍 藥 苷(106mol/L)組;⑧維拉帕米(異搏定)(10－5mol/L)+芍藥苷(10－6mol/L)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS11.5軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用表示，組間顯著性差異采用單因素方差分析法。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)脂肪組織釋放FFA的影響 與正常對(duì)照組相比〔(34.75±2.14)μmol/L〕，鹽酸腎上腺素可明顯促進(jìn)脂肪組織釋放FFA〔(192.74±18.43)μmol/L，P＜0.001)〕。低濃度芍藥苷(10－7mol/L)對(duì)脂肪組織釋放FFA無明顯的促進(jìn)作用〔(36.60 ± 2.87)μmol/L〕。中、高濃度的芍藥苷 (10－6，10－5mol/L)可分別促進(jìn)脂肪組織釋放 FFA〔(44.58±2.02)μmol/L，(54.21 ±2.81)μmol/L，P ＜0.01，P ＜0.001〕，且存在相應(yīng)的劑量效應(yīng)關(guān)系(r﹦0.839，P＜0.01)。

2.2 阻斷劑對(duì)芍藥苷促進(jìn)脂肪組織釋放FFA的影響 芍藥苷(10－6mol/L)分別和心得安(10－5mol/L)、SQ22，536(10－5mol/L)、異搏定(10－5mol/L)共同溫育時(shí)，可分別降低芍藥苷促進(jìn)脂肪組織釋放FFA的作用(54.21±2.81，37.91±2.13，36.57±1.56，36.81 ±1.38)，與濃度 10－6mol/L 的芍藥苷組相比P＜0.05和P＜0.01。

2.3 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對(duì)脂肪組織中MDA和T-AOC的影響 與正常對(duì)照組相比，鹽酸腎上腺素和芍藥苷可顯著降低脂肪組織中MDA的含量(P均＜0.001);明顯增高T-AOC水平(P ＜ 0.001，P ＜ 0.01)。心得安(10－6mol/L)、SQ22，536(10－6mol/L)、異搏定 (10－6mol/L)分別和芍藥苷(10－6mol/L)共同溫育時(shí)，其降低MDA、提高T-AOC的作用可部分被抑制，與濃度為10－6mol/L的芍藥苷組差異顯著(P＜0.001，P ＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

表1 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對(duì)離體脂肪組織中MDA和T-AOC的影響(，n=8)

表1 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對(duì)離體脂肪組織中MDA和T-AOC的影響(，n=8)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與10－6mol/L芍藥苷組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01，5)P ＜0.001

組別MDA(nmol/ml)T-AOC(IU/ml)8.76±0.34 0.54±0.15鹽酸腎上腺素(10－6mol/L) 7.48±0.742)0.88±0.172)芍藥苷(10－6mol/L) 3.94±0.312)0.74±0.151)心得安(10－5mol/L)+芍藥苷(10－6mol/L) 5.65±0.435)0.57±0.093)SQ22，536(10－5mol/L)+ 芍藥苷(10－6mol/L)5.74±0.545)0.54±0.114)異搏定(10－5mol/L)+ 芍藥苷(10－6mol/L)5.76±0.595)0.59±0.113)正常對(duì)照(0.9%NaCl)

3 討論

FFA是貯存于脂肪細(xì)胞中的TG在激素敏感脂肪酶(HLS)的催化作用下水解生成。研究發(fā)現(xiàn)激素敏感脂肪酶還可能是TG水解的限速酶。在離體的脂肪組織中，脂肪動(dòng)員過程主要由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。在嚙齒類動(dòng)物中 β3腎上腺素受體(β3AR)主要分布于白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)中。β3腎上腺素受體主要調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪分解和產(chǎn)熱過程，β3AR激動(dòng)劑通過刺激白色脂肪組織的脂解作用和棕色脂肪組織的非粟性產(chǎn)熱，消耗貯脂，起到抗肥胖作用〔2〕。β3AR屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，G蛋白貫通膜7次，并通過配體與受體結(jié)合，激活脂肪細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，增強(qiáng)環(huán)磷酰胺激活蛋白磷酸激酶A(PKA)的功效，PKA通過激活激素敏感性脂肪酶的磷酸化過程，活化激素敏感性脂肪酶，使TG分解生成FFA和甘油。大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)存在的脂被蛋白能被蛋白激酶A磷酸化〔3〕。未磷酸化的脂被蛋白可能在脂滴表面形成一種“屏障”，阻止激素敏感性脂肪酶接觸到脂滴內(nèi)的TG，從而抑制脂肪分解，腎上腺素與脂肪細(xì)胞上β3AR結(jié)合后，激活cAMPPKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，引起脂被蛋白和激素敏感性脂酶同步磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致TG水解。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)用鹽酸腎上腺素作用于脂肪組織時(shí)，可非常顯著的促進(jìn)FFA的釋放，與上述理論是一致的。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)芍藥苷也可促進(jìn)離體脂肪組織分解釋放FFA，且存在相應(yīng)的劑量效應(yīng)關(guān)系;同時(shí)還能降低MDA含量，升高T-AOC水平。非選擇性β腎上腺素受體阻斷劑心得安和AC抑制劑(SQ22，536)可部分阻斷芍藥苷促進(jìn)離體脂肪組織釋放FFA，降低MDA含量，升高總抗水平的作用，據(jù)此可推測(cè)芍藥苷的上述作用可能部分經(jīng)由 β3AR，進(jìn)而抑制cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮作用。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子的改變是細(xì)胞生理活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，鈣離子作為肌醇磷酯代謝途徑中重要的第二信使在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及誘發(fā)一系列細(xì)胞功能事件中起重要作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+來源于細(xì)胞外液Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放(主要是肌質(zhì)網(wǎng)，SR)。大量的證據(jù)表明，胞外Ca2+內(nèi)流起決定性作用，Ca2+內(nèi)流亦可激發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫中Ca2+釋放。L型鈣通道是胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道。Ca2+信號(hào)通過參與環(huán)磷腺苷(cAMP)和磷脂酰二磷酸肌醇(PIP2)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)一些酶的活性〔4〕，即激活激素敏感性脂肪酶，進(jìn)而促進(jìn)TG水解生成FFA。異搏定可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，改變細(xì)胞對(duì)各種受體介導(dǎo)信號(hào)反應(yīng)的能力〔5〕。有報(bào)道赤芍總苷能明顯提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度〔6〕。本實(shí)驗(yàn)選用L型鈣通道阻斷劑異搏定后，抑制了芍藥苷促進(jìn)離體脂肪組織釋放FFA、降低MDA、升高T-AOC的作用，且芍藥苷是赤芍總苷的主要化學(xué)成分，因此推測(cè)芍藥苷的作用可能部分經(jīng)L型鈣通道起作用。

肥胖時(shí)血脂升高，脂質(zhì)過氧化可使自由基產(chǎn)生增多及解偶聯(lián)蛋白水平下降。MDA是脂質(zhì)過氧化的終末反應(yīng)產(chǎn)物之一。過多的脂質(zhì)過氧化物可消耗細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和維生素E，導(dǎo)致機(jī)體酶促及非酶促防御體系的T-AOC減弱〔7〕。在本實(shí)驗(yàn)中，鹽酸腎上腺素在促進(jìn)脂肪組織釋放FFA的同時(shí)，可降低MDA含量升高T-AOC。芍藥苷亦具有此作用。說明芍藥苷可清除脂肪組織過多的自由基，提高T-AOC。有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素是內(nèi)源性的抗氧化劑，但同時(shí)又具有促氧化作用。芍藥苷是否有促氧化作用，及促進(jìn)FFA釋放與其抗氧化能力之間是否存在因果關(guān)系尚需進(jìn)一步探討。

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