陳春球， 丁衛(wèi)星， 李永渝

(1同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072;2同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，上海 200092)

褪黑素(melatonin)最先被發(fā)現(xiàn)是在松果體中合成并周期性分泌的，它作為內(nèi)分泌激素之一調(diào)控機(jī)體的生物節(jié)律，主要參與對(duì)清醒和睡眠周期的調(diào)控。后來發(fā)現(xiàn)褪黑素亦參與了機(jī)體進(jìn)食和消化功能的調(diào)節(jié)［1］。1995年在腸道中發(fā)現(xiàn)合成褪黑素的酶，認(rèn)為褪黑素可在松果體外的腸道合成［2］。褪黑素在腸道內(nèi)有旁分泌作用且具有連續(xù)性或周期性分泌。褪黑素對(duì)腸道功能的影響已有多方面的研究，但對(duì)于腸道動(dòng)力調(diào)控及其機(jī)制并不明確。本研究通過檢測(cè)不同濃度褪黑素對(duì)于結(jié)腸和全胃腸道運(yùn)輸能力的影響，以及褪黑素拮抗劑應(yīng)用后的作用變化，初步探討褪黑素對(duì)胃腸動(dòng)力作用特點(diǎn)。

材料和方法

1 材料與試劑

雄性C57BL小鼠，體重20～25 g，由同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。褪黑素和luzindole購自Tocris。常規(guī)溶劑 DMSO和伊文斯藍(lán)購自 Sigma－Aldrich。褪黑素和luzindole的溶劑和空白對(duì)照試劑均用3%DMSO。5% 伊文斯藍(lán)+5% 阿拉伯樹膠配成伊文斯藍(lán)溶液。

2 結(jié)腸玻璃珠推排實(shí)驗(yàn)

用C57BL小鼠60只，禁食不禁水12 h，隨機(jī)均分成5組，即對(duì)照組、不同劑量褪黑素組(1 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg組)，異氟醚吸入麻醉下腹腔注射對(duì)照溶劑(3%DMSO)或不同劑量褪黑素，分別在注射15 min和45 min后，取每組鼠6只，用特制的硅膠棒，將預(yù)熱(37℃)的玻璃珠1粒(直徑2 mm)推入遠(yuǎn)端結(jié)腸20 mm，然后將小鼠單獨(dú)置于干凈籠中，記錄玻璃珠排出時(shí)間。玻璃珠排出時(shí)間越短，說明藥物對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)越強(qiáng)，反之則抑制結(jié)腸運(yùn)動(dòng)。如果超過30 min玻璃珠未能排出，斷頭處死小鼠并確定玻璃珠的位置和明確原因。

另用2組小鼠(6只/組)在注射大劑量褪黑素(75 mg/kg)或溶劑前15 min，腹腔內(nèi)注射褪黑素拮抗劑luzindole(5 mg/kg)，在注射褪黑素15 min后同上處理，觀測(cè)結(jié)腸玻璃珠的排推情況。另取2組小鼠為對(duì)照組，包括空白對(duì)照組和注射luzindole+溶劑對(duì)照組(6只/組)，后者主要用于觀測(cè)褪黑素拮抗劑luzindole本身對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的可能影響。

3 全胃腸道運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)

取C57BL小鼠30只，同上空腹處理后隨機(jī)均分成5 組，腹腔內(nèi)注射 1 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg 和75 mg/kg褪黑素或?qū)φ杖軇?5 min后，每只鼠灌胃1.5 mL預(yù)溫(37℃)的伊文斯藍(lán)試劑。將小鼠放回原各自籠中。記錄從灌胃結(jié)束到第1顆藍(lán)色糞粒排出的時(shí)間，作為全胃腸道運(yùn)輸時(shí)間。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 腹腔內(nèi)注射褪黑素15 min后結(jié)腸玻璃珠排推時(shí)間變化

在結(jié)腸玻璃珠排推實(shí)驗(yàn)中，腹腔內(nèi)注射不同濃度褪黑素15 min后，褪黑素濃度為1 mg/kg時(shí)，結(jié)腸排出玻璃珠的時(shí)間縮短，與注射溶劑的對(duì)照組比較存在顯著差異(P＜0.01);在濃度為5 mg/kg和50 mg/kg時(shí)，玻璃珠排出時(shí)間與對(duì)照組比較無顯著差異;在褪黑素濃度為75 mg/kg時(shí)，結(jié)腸排出玻璃珠的時(shí)間延長，與對(duì)照組比較存在顯著差異(P＜0.01)。結(jié)果表明用藥15 min后，玻璃珠排出時(shí)間總的趨勢(shì)是隨著褪黑素濃度的增加，結(jié)腸動(dòng)力由加快轉(zhuǎn)為降低，見圖1。

2 腹腔內(nèi)注射褪黑素45 min后結(jié)腸玻璃珠排推時(shí)間變化

在腹腔內(nèi)注射不同濃度褪黑素后45 min，結(jié)腸排推玻璃珠實(shí)驗(yàn)結(jié)果與用藥15 min的有所不同:褪黑素濃度為5 mg/kg時(shí)，結(jié)腸排推時(shí)間縮短(P＜0.01);在1 mg/kg和50 mg/kg劑量時(shí)，與對(duì)照組比較并無顯著差異;在75 mg/kg時(shí)，結(jié)果同上，玻璃珠排出時(shí)間延長，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)，見圖2。

3 褪黑素拮抗劑在結(jié)腸玻璃珠排推實(shí)驗(yàn)中的作用

用褪黑素拮抗劑luzindole 5 mg/kg單獨(dú)腹腔內(nèi)注射，該藥本身對(duì)結(jié)腸玻璃珠排出時(shí)間沒有明顯影響;但與褪黑素合用，能一定程度拮抗大劑量褪黑素(75 mg/kg)對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的抑制，玻璃珠排出時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)，見圖3。

4 褪黑素對(duì)全胃腸道運(yùn)輸時(shí)間的作用

在全胃腸道運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，腹腔內(nèi)注射褪黑素1 mg/kg和5 mg/kg后全腸道運(yùn)動(dòng)加快，排出伊文斯藍(lán)糞粒出現(xiàn)早，與溶劑對(duì)照組比較差異顯著(均P＜0.01)。但當(dāng)腹腔內(nèi)注射大劑量褪黑素(75 mg/kg)時(shí)，腸道運(yùn)動(dòng)減慢，排出伊文斯藍(lán)糞粒的時(shí)間明顯延長(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 1.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice at 15 min..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 腹腔內(nèi)注射不同劑量褪黑素15 min后結(jié)腸玻璃珠排推時(shí)間的變化

Figure 2.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice at 45 min..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 腹腔內(nèi)注射不同劑量褪黑素45 min后結(jié)腸玻璃珠排出時(shí)間的變化

討 論

褪黑素(化學(xué)名為 N－acetyl－5－methoxytryptamine)被發(fā)現(xiàn)于1917年，后來在人類、動(dòng)物、植物和微生物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。1974年褪黑素被發(fā)現(xiàn)存在于腸道的闌尾組織中。褪黑素是一種脂溶性物質(zhì)，能快速通過各種生物膜，參與許多調(diào)節(jié)過程，如生物節(jié)律、腸道反射、抗炎、新陳代謝和生殖等。另外，褪黑素可能作為不同臟器之間信息交流的介質(zhì)［3］。Bubenik等［4］最先報(bào)道褪黑素存在于腸道黏膜中，分別被免疫組化和放射免疫學(xué)方法所證實(shí)。在哺乳動(dòng)物腸道，褪黑素的分布不一致，在結(jié)腸、直腸中含量最高，空腸和回腸最低。褪黑素為腸道中的嗜鉻細(xì)胞合成，并且褪黑素的分布量與腸道內(nèi)的嗜鉻細(xì)胞分布密度相一致［5］。部分腸道，特別是低位腸道內(nèi)褪黑素是由血液循環(huán)中的褪黑素積聚而來，表現(xiàn)為松果體源性褪黑素的儲(chǔ)存容器。但腸道內(nèi)褪黑素的濃度具有獨(dú)立性，因?yàn)樵谇谐晒w的大鼠其腸道內(nèi)褪黑素的濃度并未受影響，在任何時(shí)間腸道內(nèi)褪黑素濃度至少比血中濃度高400倍，且腸道內(nèi)濃度與年齡有關(guān)［6］。限制飲食能增加小鼠腸道和大腦中的褪黑素濃度。這些發(fā)現(xiàn)表明褪黑素可能參與調(diào)節(jié)消化和進(jìn)食的功能。

Figure 3.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of melatonin(75 mg/kg)and melatonin antagonist luzindole(5 mg/kg)in mice at 15 min..n=6.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs luzindole+melatonin.圖3 腹腔內(nèi)注射褪黑素拮抗劑luzindole對(duì)大劑量褪黑素(75 mg/kg)延長結(jié)腸玻璃珠排出時(shí)間的影響

Figure 4.Changes of the gastrointestinal transit time after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice(Evans blue test)..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖4 腹腔內(nèi)注射不同劑量褪黑素后全胃腸道運(yùn)輸時(shí)間的變化

褪黑素受體存在于小腸和結(jié)腸中，褪黑素通過膜上特異受體激活生理功能。褪黑素受體包括MT1、MT2 和 MT3［7］。MT1 和 MT2 均為 G 蛋白偶聯(lián)受體家族，具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，但它們的膜內(nèi)通路完全不同［8］。Luzindole可拮抗 MT1和 MT2，MT2還有特異性拮抗劑4－P－PDOT，目前尚無單獨(dú)的MT1拮抗劑。MT1 mRNA表達(dá)在十二指腸和低位的空回腸最高，并且表達(dá)沒有周期節(jié)律性。在短期禁食后，大鼠小腸和結(jié)腸表皮下層MT1受體表達(dá)量增加，但長期禁食其表達(dá)量又會(huì)恢復(fù)正常。通過免疫化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，在大鼠MT2表達(dá)在腸道的黏膜肌層以及環(huán)形和縱行肌層中，提示 MT2參與調(diào)節(jié)腸道的動(dòng)力［9］。MT3受體是一種酶，為醌還原酶2(quinone reductase 2，QR2)，能被哌唑嗪所拮抗，可能參與抗氧化的作用。

有研究報(bào)道，褪黑素可能參與調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力，腸道免疫，腸道分泌等［10］，但具體的作用機(jī)理并不明確。對(duì)腸道動(dòng)力方面的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能很快滲透通過黏膜層和黏膜下層，作用于黏膜肌層或腸道神經(jīng)叢。褪黑素通過激活褪黑素受體調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力，在這過程中MT2受體最有可能參與［11］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，褪黑素依賴于濃度的變化，興奮或抑制腸道的動(dòng)力。在予以小劑量褪黑素后，能加快大鼠腸道動(dòng)力，縮短運(yùn)輸時(shí)間，但在大劑量時(shí)減慢腸道動(dòng)力，并且這些作用均能為MT1和MT2受體阻滯劑luzindole阻斷［12］。這與我們對(duì)小鼠的研究結(jié)果相一致:小劑量給予褪黑素，小鼠結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)加快，排出玻璃珠的時(shí)間明顯縮短，而用大劑量則減慢結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，排出玻璃珠的時(shí)間明顯延長。在對(duì)小鼠全胃腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中也得到相似結(jié)果。并且應(yīng)用luzindole后能阻斷大劑量褪黑素對(duì)結(jié)腸動(dòng)力的抑制。

對(duì)褪黑素影響或調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的機(jī)制目前不清楚。體外研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能減少大鼠小腸和結(jié)腸的自發(fā)性收縮力，但腸道收縮頻率并不改變。內(nèi)、外源性褪黑素能抑制進(jìn)食前后腸道運(yùn)動(dòng)的不規(guī)則波，認(rèn)為可能與褪黑素作用于腸道神經(jīng)元有關(guān)［13］。近來的研究認(rèn)為，褪黑素可能作用于腸道5－HT(5－h(huán)ydroxytryptamine)受體，抑制5－HT轉(zhuǎn)送蛋白的活性，抑制腸上皮細(xì)胞對(duì)5－HT的再攝?。?4］。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性褪黑素能減輕大鼠腸炎的腹瀉癥狀，但參與的機(jī)制并未能闡明［15］。本研究初步看到低濃度褪黑素促進(jìn)小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)、高濃度褪黑素則抑制其運(yùn)動(dòng)。然而，其中的機(jī)制是什么?這些作用是否有MT1和MT2的同時(shí)參與?它們?nèi)绾握{(diào)控胃腸道動(dòng)力?這些問題有待下一步研究。

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