張 弘， 許可銀， 周國雄， 朱郁飛， 魏 群， 李 峰

(1南通大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 南通 226001;2鹽城市城南醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 鹽城 224001)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種嚴重的全身性疾病，病情兇險，死亡率高［1］，其嚴重程度及多器官功能障礙與多種細胞因子級聯(lián)反應密切相關，但趨化因子在其中起了何種作用尚不十分清楚。趨化因子是一類能趨化細胞定向移動的小分子分泌蛋白，其主要作用為趨化和激活白細胞，參與炎癥反應，其氨基酸組成具有特異的半胱氨酸，根據(jù)半胱氨酸的排列位置不同可分為 C、CC、CXC和CX3C 4類共50余種。目前認為，fractalkine(FKN)是CX3C族中的唯一成員，主要表達于人體活化的內(nèi)皮細胞表面，同時也可以可溶性形式存在，在炎癥局部發(fā)揮其誘導細胞聚集和維持穩(wěn)態(tài)等作用［2，3］。本實驗通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，并采用烏司他丁(ulinastatin，UT)進行干預，ELISA法檢測不同時點血清中FKN水平;采用實時熒光定量PCR法檢測FKN mRNA在SAP模型的胰腺組織和肺組織中的表達變化情況，及其與病理組織學改變的關系，探討FKN在SAP發(fā)病過程中的作用，為臨床工作中急性胰腺炎治療方案的進一步完善提供新的實驗基礎和理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠72只，清潔級，體重(200±30)g，由南通大學實驗動物中心提供，隨機分成3組:SAP組、烏司他丁治療組(SAP+ulinastatin treatment，SAP+UT)和生理鹽水對照組(control)，每組24只。

1.2 主要試劑 淀粉酶測定試劑盒(四川邁克科技有限公司);大鼠FKN ELISA試劑盒(上海西唐生物公司);Total RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］;自行設計FKN和GAPDH引物，由上海博彩生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 動物模型 大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水6 h，用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，正中切口進腹，膽胰管十二指腸開口處予無損傷金屬夾夾閉，注射器針頭向十二指腸開口方向插入膽胰管，SAP組以0.1 mL/min的速度向膽胰管內(nèi)注射4%?；悄懰徕c，劑量為1 mL/kg，5 min后拔除注射針，松開金屬夾，縫合關腹;UT在造模成功后立即在大腿皮下注射UT(3×104U/kg)進行干預治療;對照組向膽胰管注射與?；悄懰徕c組等量的無菌生理鹽水。每組再隨機分成4個亞組，每個亞組6只大鼠。分別于術(shù)后1、3、6、12 h予以處死，心臟取血，置37℃30 min后離心收集血清于4℃保存，用于淀粉酶和ELISA檢測;留取胰腺和肺組織，一份－80℃貯存用于實時熒光定量PCR;一份放入4%甲醛，用于病理學檢測。

2.2 血清淀粉酶(amylase，AMS)測定 采用碘－淀粉比色法，操作嚴格按照試劑說明書進行，由美國Vitros－250型全自動生化分析儀測定。

2.3 血清FKN ELISA檢測 取出酶標板，設空白孔，依次加入標準品及樣本血清各100 μL于包被好抗大鼠FKN單抗的各孔中，37℃孵育2 h，然后嚴格按照試劑盒說明書要求進行洗板操作，分別加入生物素化的Ⅰ抗、辣根過氧化酶標記的鏈霉親和素及底物甲基聯(lián)苯胺溶液，經(jīng)終止液作用后30 min內(nèi)用Therm。MK3型酶標儀在450nm處測吸光度值(A值)。

2.4 實時熒光定量PCR檢測 ?。?0℃冷凍保存的組織50－100 mg用RNAiso Plus試劑，嚴格按操作手冊提取胰腺和肺組織總RNA，采用紫外分光光度法定量RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系包括1 μL總 NRA;2 μL 5×逆轉(zhuǎn)錄buffer;0.5 μL oligo dT;0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I，加 DEPC 水至總體積 10 μL，反應條件如下:37℃ 15 min;85℃ 5 s。自行設計大鼠GAPDH及CX3CL1引物各一對，F(xiàn)KN上游引物5'－TGCCACAAGATGACCTCGCCA －3'，下游引物 5'－TCCAGGTGCTTCATGGCGTCT－3'，擴增產(chǎn)物片段大小為164 bp;GAPDH上游引物 5'－AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC －3’，下游引物5'－GAGCAATGCCAGCCCCAGCA－3’，擴增產(chǎn)物片段大小為130 bp。取2 μL cDNA模板進行 RT－qPCR，加入 SYBR premix Ex Taq 12.5 μL，引物各 0.5 μL，再加入滅菌蒸餾水使反應體積為25 μL。PCR反應采用兩步法，條件為:預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，然后進入熔解曲線測定程序。最后計算ΔCt值和RQ值。

2.5 組織病理學檢查 所有大鼠處死后均做病理檢查，所取的胰腺組織和肺組織標本常規(guī)脫水、石蠟包埋，5 μ厚切片，行HE染色，進行組織病理學觀察。胰腺組織和肺組織病理學評分及分級，均由2位專業(yè)的病理醫(yī)師雙盲閱片，每組隨機取3張切片，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，以水腫、感染、出血和壞死評價胰腺組織損傷的程度。胰腺組織具體參考Rongione等［4］的評分標準，進行病理評分，各項最低分為0分，最高分為4分，取各項積分總和為最終得分。肺組織病理學評級具體參考雷文章等［5］的評級標準進行評級，最低級為0級，最高級為Ⅲ級。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 血清淀粉酶活性的變化

SAP 和UT 組1 h、3 h、6 h、12 h 各亞組血清淀粉酶活性與對照組比較均明顯升高，差異顯著(P＜0.01);UT組與SAP組相比較，1 h和3 h兩亞組間沒有顯著差異(P＞0.05);而6 h和12 h，UT組血清淀粉酶活性升高程度比SAP組顯著減低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組不同時點血清淀粉酶活性的變化Table 1.Changes of serum amylase activity in each group at various time points(U/L..n=6)

表1 各組不同時點血清淀粉酶活性的變化Table 1.Changes of serum amylase activity in each group at various time points(U/L..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs SAP group.

Control 725±129 1646±144 2004±107 2168±140 SAP 2441±218＊＊ 3552±283＊＊ 6576±265＊＊ 7666±409＊＊SAP+UT 2176±220＊＊ 3260±182＊＊ 4672±236＊＊##4952±208＊＊##

2 血清FKN濃度的變化

SAP組血清FKN水平隨時間變化逐漸升高，在1 h時點，3組間血清FKN水平變化無顯著差異(P＞0.05);SAP組在3h、6h和12h血清FKN水平高于對照組，差異顯著(P＜0.05)，而UT組與對照組之間血清FKN水平差異無顯著(P＞0.05)，SAP組與UT組血清FKN水平在6 h和12 h時，顯著差異，見表2。

表2 各組不同時點血清FKN濃度的變化Table 2.Changes of serum FKN level in each group at various time points(ng/L..n=6)

表2 各組不同時點血清FKN濃度的變化Table 2.Changes of serum FKN level in each group at various time points(ng/L..n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 115.6 ±6.5 140.1±5.3 147.8±5.7 168.4±5.9 SAP 121.7 ±5.1 172.4±8.7* 188.6±11.9* 240.8 ±10.1*SAP+UT 118.1 ±9.3 150.2±5.6 153.2±4.6# 175.1 ±10.3#

3 胰腺組織FKN mRNA的表達

SAP組胰腺組織FKN mRNA的表達隨時間變化逐漸升高，SAP組1h與對照組相比無顯著差異，3 h表達高于對照組(P＜0.05)，6和12 h表達顯著高于對照組(P＜0.01);UT組各時點與對照組相比均無顯著差異，UT組3 h、6 h和12 h時點胰腺組織FKN mRNA表達均低于SAP組，見表3。

表3 各組不同時點胰腺組織中FKN mRNA表達的變化Table 3.Changes of FKN mRNA expression in pancreas in each group at various time points(.n=6)

表3 各組不同時點胰腺組織中FKN mRNA表達的變化Table 3.Changes of FKN mRNA expression in pancreas in each group at various time points(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 0.15±0.02 0.25±0.04 0.38±0.04 0.49±0.04 SAP 0.15±0.01 0.32±0.02* 0.50±0.05＊＊ 0.78±0.04＊＊SAP+UT 0.16±0.10 0.25±0.03# 0.40±0.03# 0.59±0.05#

4 肺組織FKN mRNA的表達

SAP組肺組織FKN mRNA的表達隨時間變化逐漸升高，SAP組1 h與對照組相比無顯著差異，3 h、6 h和12 h表達顯著高于對照組(P＜0.01);UT組3 h、6 h和12 h時點肺組織FKN mRNA的表達均低于SAP組的表達;UT組與對照組相比較，各時點無顯著差異，見表4。

表4 各組不同時點肺組織FKN mRNA表達的變化Table 4.Changes of FKN mRNA expression in lung in each group at various time points(.n=6)

表4 各組不同時點肺組織FKN mRNA表達的變化Table 4.Changes of FKN mRNA expression in lung in each group at various time points(.n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 0.06 SAP 0.13±0.03 0.34±0.06* 0.46 ±0.07* 0.68±0.06*SAP+UT 0.12±0.02 0.23±0.03# 0.39±0.05# 0.46±0.05 Control 0.11±0.02 0.19±0.04 0.28 ±0.05 0.38±#

5 胰腺組織病理學改變及評分

對照組大鼠胰腺光鏡下細胞結(jié)構(gòu)清楚、完整，小葉界限明確，間質(zhì)無水腫，但是有少量炎癥細胞浸潤，偶見點狀出血，極少量腺泡細胞壞死。

SAP組術(shù)后1 h、3 h可見明顯小葉間水腫，片狀出血，炎癥細胞浸潤，部分腺泡細胞變性、壞死;術(shù)后6 h、12 h可見大量炎癥細胞浸潤，片狀出血，胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量腺泡細胞壞死。胰腺組織HE染色，光鏡下可見胰腺實質(zhì)大片壞死，間質(zhì)出血并有大量炎癥細胞浸潤，小葉輪廓破壞。

UT組1 h、3 h可見胰腺間質(zhì)輕度水腫，6 h除間質(zhì)水腫外，有炎癥細胞浸潤及點狀出血壞死，12 h炎癥細胞浸潤進一步增加，有局灶壞死。UT組各時點與SAP組相比，胰腺病理損傷明顯減輕;光鏡下可見胰腺實質(zhì)有小片狀壞死灶，間質(zhì)出血并仍有較多的炎癥細胞浸潤。各組不同時點胰腺組織病理評分見表5。

表5 各組不同時點胰腺組織病理評分Table 5.Pathological scores of pancreatic tissues in each group at various time point(.n=6)

表5 各組不同時點胰腺組織病理評分Table 5.Pathological scores of pancreatic tissues in each group at various time point(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 1.89±0.23 1.96±0.14 2.37±0.36 3.08±0.27 SAP 5.73±0.35＊＊ 7.40±0.21＊＊ 10.22±0.43＊＊ 11.15±0.81＊＊SAP+UT 3.29±0.30 4.13±0.27 6.34±0.51# 7.62±0.42#

6 肺組織病理學改變及評級

對照組各時點肺組織未見明顯水腫及炎癥細胞浸潤，亦未見出血和肺泡細胞壞死。光鏡下見肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見明顯滲出液。

SAP組術(shù)后1 h亦未見明顯變化，組織病理評級為0級;術(shù)后3 h可見肺間質(zhì)水腫，少量炎癥細胞浸潤，偶見點狀出血和肺泡細胞壞死，組織病理學評級為Ⅰ級;術(shù)后6 h見肺泡隔增寬，肺內(nèi)小血管擴張充血，有較多的中性粒細胞浸潤，組織病理學評級為Ⅱ級;術(shù)后12 h鏡下見肺間質(zhì)水腫，彌漫性出血，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，大量肺泡細胞壞死。血管擴張瘀血，有大量炎癥細胞浸潤，組織病理學評級為Ⅲ級。

UT組各時點肺病理學改變與SAP組相比，3 h后各時點癥狀明顯減輕，未見斑片狀壞死，肺泡間隔變薄，仍有一些炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，組織病理學評級為I級。

討 論

SAP是消化系統(tǒng)的急腹癥，病程兇險，發(fā)展快，死亡率高［6，7］。其發(fā)病機制尚未完全明了，目前認為在其形成過程中，炎癥細胞的浸潤起著重要作用，在發(fā)病早期階段就可出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)且并發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，造成胰腺以外的重要臟器發(fā)生功能性和器質(zhì)性的損傷［6］。本實驗結(jié)果表明，SAP組和對照組術(shù)后1 h，胰腺組織中FKN mRNA表達水平升高不明顯，與對照組相比，無顯著差異。然而SAP大鼠術(shù)后3 h－12 h胰腺組織中FKN mRNA的表達明顯高于對照組，顯著差異。此時我們從病理切片中觀察到胰腺組織的病理損害程度不斷加重，提示FKN可能在SAP發(fā)病過程中起了重要作用。研究表明［8－10］，急性胰腺炎(AP)時受損的胰腺組織作為抗原或炎癥刺激物激活巨噬細胞等炎癥細胞釋放大量細胞因子，進而通過扳機樣作用，觸發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)反應，細胞因子網(wǎng)絡和免疫功能紊亂很可能是AP極易從局部病變迅速發(fā)展為SIRS和多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)的實質(zhì)所在。

趨化因子是一類控制細胞定向遷移的細胞因子，其功能的行使由趨化因子受體介導，趨化因子與其受體的相互作用控制著各種免疫細胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間的定向遷移，使免疫細胞到達感染部位，執(zhí)行清除感染，維持組織細胞平衡的功能。本實驗中，模型組血清中FKN水平隨著時間的延長不斷增高，SAP組和對照組術(shù)后1 h，血清中檢測到有少量的FKN表達;SAP大鼠術(shù)后3 h－12 h檢測到血清FKN水平不斷升高，與對照組相比差異顯著。提示?；悄懰徕c的作用，使胰腺組織不斷釋放出趨化因子FKN并進入血流。循環(huán)中的FKN因子對中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等均有趨化作用，使機體內(nèi)大量炎癥細胞不斷進入炎癥組織。此時我們病理組織切片觀察到，在3 h－12 h的胰腺組織中有大量炎癥細胞浸潤，并伴有胰腺組織的壞死。隨著時間的延長，胰腺組織病理學積分也不斷增高。我們推測，F(xiàn)KN因子的大量滲出進入血流，誘導了大量炎癥細胞游走進入胰腺組織，促進了炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生和發(fā)展，從而導致了大量胰腺腺泡細胞的壞死。

UT是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白。UT屬于蛋白酶抑制劑，不僅對胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。本研究結(jié)果顯示，我們在大鼠SAP模型建立后立即皮下注射UT，6 h后血清淀粉酶顯著下降，胰腺組織病理改變明顯減輕，提示UT對SAP有較明顯的治療作用。我們還注意到，經(jīng)熒光定量PCR檢測胰腺組織FKN mRNA的表達，在3 h后B組胰腺組織中FKN mRNA表達較A組胰腺組織中表達減弱，檢測其血清中FKN蛋白的含量，B組血清FKN的含量也較A組血清明顯降低。提示UT能顯著改善大鼠SAP嚴重程度，其機制可能與抑制了趨化因子FKN表達有一定關系。

急性胰腺炎相關的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是急性胰腺炎SIRS在肺部的表現(xiàn)，嚴重者出現(xiàn)急性呼吸性窘迫綜合征(ARDS)和MODS。SAP合并ALI，病情兇險，死亡率高，約1/3的SAP合并ALI和ARDS，并且約60%死亡病例是由后2種并發(fā)癥引起［11－13］。本實驗中我們觀察到，SAP大鼠術(shù)后1 h肺部FKN mRNA表達開始升高，但此時統(tǒng)計學分析兩者間無顯著差異。病理切片組織學觀察顯示此時未見明顯變化。SAP大鼠術(shù)后3 h－12 h檢測肺部組織FKN mRNA表達與對照組比較，明顯增加，此時病理組織學觀察顯示，在3 h時點可見到有少量炎癥細胞浸潤及肺間質(zhì)水腫等病理現(xiàn)象。術(shù)后6 h－12 h可見大量炎癥細胞浸潤，并伴有水腫、出血和細胞壞死。提示FKN在SAP相關的ALI中起了重要作用。同時，本研究結(jié)果顯示SAP大鼠術(shù)后3 h FKN就在肺組織內(nèi)明顯表達。而我們早先對MCP－1在大鼠急性胰腺炎肺損害中的作用研究顯示，MCP－1在大鼠術(shù)后3 h肺組織內(nèi)表達尚未明顯升高［14，15］，提示FKN很可能較早參與了AP相關的ALI的發(fā)生，這一結(jié)果為研究急性胰腺炎相關ALI的發(fā)生機制提供了基礎理論依據(jù)。

我們在研究中注意到，隨著實驗時間的延長，各實驗對照組的結(jié)果也隨之增高。造成這樣的結(jié)果我們認為可能有兩個原因，一是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起對照組趨化因子表達水平的增高;二是由于在造模過程中我們采用的是逆向膽胰管內(nèi)注射的方法，膽胰管損傷及逆向注射時一定的壓力可能會引起局部組織損傷，也可能會導致各對照組實驗結(jié)果的增高。我們認為這一結(jié)果比較客觀地反映了實驗過程中其它因素對實驗結(jié)果的影響，實驗對照組是實驗設計中必不可少的。

趨化因子及其受體的表達及功能異常將導致免疫細胞不能在正常位置行使其正常功能。因此，以趨化因子及其受體分子為治療靶點，通過激活或者拮抗趨化因子受體的信號轉(zhuǎn)導來調(diào)控趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于控制和治療相關疾病。

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