李翊衛(wèi)， 王曄愷， 周吉航， 周世權， 方國安， 劉曉光

(舟山醫(yī)院1檢驗科，2細胞分子生物學實驗室，浙江 舟山 316004)

慢性粒細胞性白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種起源于骨髓多能干細胞的惡性增殖性疾病，起病隱匿，一旦急變，治療困難，死亡率高［1，2］。因此，對 CML 急變的早期監(jiān)測尤為重要。時鐘基因在宏觀上能作用于前下丘腦視上核影響生物鐘變化［3］，在微觀上對多種腫瘤細胞的增殖分化存在密切影響［4，5］。但時鐘基因與白血病的報道不多，我們通過觀察CML急變中時鐘基因hPer3(human period 3)的表達和啟動子甲基化水平變化，并將hPer3基因轉染CML細胞株K562觀察對其的抑制和促凋亡作用，以明確hPer3基因在CML急變中的作用及檢測價值。

材料和方法

1 臨床資料

收集我院2006年1月－2010年11月門診和住院CML患者骨穿標本29例，抽取時間均為上午8:00 －10:00，瑞氏染色法鏡檢確定 FAB 分型［6］，CML慢性期17例，男10例，女7例，中位年齡43(39－57)歲，CML加速期6例，男4例，女2例，中位年齡46(37－53)歲，CML急變期6例，男5例，女1例，中位年齡49(37－62)歲，以良性血液病組40例(均為缺鐵性貧血)為對照，樣本抽取時間同上，男21例，女19例，中位年齡37(18－62)歲，良性血液病組骨穿檢查均符合臨床指征，采用肝素抗凝針筒留取2－4 mL骨髓，－80℃冰箱保存。

2 儀器和試劑

DNA純化試劑盒和普通PCR擴增試劑盒購自Promega，對苯二酚、亞硫酸氫鈉、氯仿、氫氧化鈉購自上海晶純試劑有限公司，DNA marker購自廣州東盛生物科技有限公司，Trizol購自Invitrogen，CpG甲基轉移酶(CpG methyltransferase，M.SssI)購自北京NEB，pMD18載體試劑盒和熒光定量 PCR試劑盒(SYBR Green I)購自TaKaRa，小牛血清和 RPMI－1640培養(yǎng)液購自碧云天，K562細胞株購自中科院上海細胞庫。甲基化特異性－PCR引物:MSF正義鏈5'－ CGGGAGTTTTGGGTATTCGC － 3'，反義鏈 5'－CGACCCGACTAACTAAAACG－3'，甲基化產物 182 bp;USF正義鏈5'－TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT －3'，反義鏈 5'－AATCCAACACCAACAACCCAACTAACT AAAACA －3'，非甲基化產物207 bp;熒光定量 PCR引物:hPer3正義鏈 5'－ACAAACAGAACCACAAGGCA －3'，反義 鏈 5'－CGTCCATTTGTTGGCATTT －3'，擴增產物 94 bp;GAPDH正義鏈 5'－GACCTGACCTGCCGTCTA －3'，反義鏈 5'－ AGGAGTGGGTGTCGCTGT－3'，擴增產物148 bp;pcDNA3.1 －h(huán)Per3 PCR 引物:pcDNA3.1－h(huán)Per3正義鏈5'－CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGC CCCGCGGG-GAAGCTCC －3'，反義鏈 5'－CGGGCCCTCTAGACTC-GAGTTACG TTCGAACTTTATGCC－3';均由上海生工合成。hPer3質粒模板由舟山同生生物科技有限公司協助構建。凝膠成像系統為Bio－Rad公司Universal Hood II型，凝膠成像分析軟件為Quantity One，普通 PCR 儀為 Roche Mycycle，熒光PCR儀為Roche Lightcycle。

3 方法

3.1 生物信息學分析 從MethDB數據庫中選取hPer3啟動子中富含CpG島的－465～269位點區(qū)域利用ABI MethPrimer軟件設計甲基化引物:MSF正義鏈(－453～444)，反義鏈(－281～301);非甲基化引物:USF正義鏈(－465～444)，反義鏈(－269～301)。

3.2 hPer3 mRNA 檢測

3.3 hPer3基因啟動子甲基化檢測

為加強日常的運行與管理，保證工程的良性運行，避免因職能設置混亂、相互扯皮及人員分工的不合理造成不應有的經濟損失而影響日常的正常通水要求，應建立健全各項規(guī)章制度、完善職能分工和搞好人員的優(yōu)化配置。

①hPer3和GAPDH標準品構建 用Trizol提取骨髓總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉錄成cDNA進行逆轉錄PCR，反應體系25 μL:其中 DNA 模板 2 μL，10 μmol/L hPer3 或 GAPDH 熒光定量 PCR 引物各1 μL，5 ×PCR 緩沖液5 μL，加去RNA酶水補至25 μL，反應條件:95℃ 10 min;95℃20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR反應產物經純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片段4.5 μL、pMD18 －T 載體 0.5 μL，低速離心后于16℃連接過夜，將連接液轉化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養(yǎng)過夜，抽提其質粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測序確認。

②實時熒光定量PCR 將重組質粒倍比梯度稀釋作為標準品，用①中的cDNA進行SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測，反應體系參照試劑說明書，反應條件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃ 10 min，利用各自的標準曲線分別對樣品中目的基因和內參照基因分別進行定量，骨髓組織或白血病細胞株中hPer3基因mRNA的相對表達量為hPer3基因拷貝數/GAPDH基因拷貝數。

歸一化的效果是將原始數據映射到[0,1]區(qū)間,之后用訓練集對SVM進行訓練,最后用得到的模型來預測測試集分類標簽.本文中選取能較好反映5種狀態(tài)的18名被試的總共300組典型數據作為訓練集,再選取另外的200組數據作為測試集.設置5種交互狀態(tài)下類別標簽分別為(0;1;2;3;4).

③結果判定 甲基化引物進行擴增有產物而非甲基化擴增無產物為完全甲基化，甲基化引物和非甲基化擴增都有產物為部分甲基化，甲基化引物進行擴增無產物而非甲基化擴增有產物為無甲基化。完全和部分甲基化判定為甲基化陽性，無甲基化為甲基化陰性。

①“村兩委”成立公共衛(wèi)生委員會，加強對村民“綠色生活”教育，提高村民環(huán)保意識。加強農村環(huán)境衛(wèi)生綜合治理，制定衛(wèi)生公約，定期開展衛(wèi)生檢查和評定。對污染嚴重的鄉(xiāng)村企業(yè)，由鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）政府下達限期整改、取締或關閉的通知。

②甲基化特異性PCR 以ddH2O為空白對照，用經M.SssI處理后的基因組DNA為陽性對照。反應體系25 μL，其中 DNA 模板 2 μL，10μmol/L 甲基化或非甲基化正反向引物各1 μL，5×PCR 緩沖液5 μL，加去離子水補至25 μL。95℃預變性15 min;94℃50 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán);72 ℃ 5 min，完成擴增反應，產物用2%的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀紫外燈下觀察結果。

①組織DNA抽提和甲基化修飾 采用苯酚氯仿法抽提患者骨髓基因組DNA和細胞株基因組DNA，采用紫外分光光度計測量測定吸光度，確定其純度。吸取4 μL基因組DNA至40 μL去離子水中，加10 μL 3 mol/L的氫氧化鈉，37℃孵育20 min，加入30 μL 10 mmol/L 的對苯二酚和520 μL 1.5 mol/L 的亞硫酸氫鈉，50℃孵育16 h，應用DNA純化試劑盒純化回收，加入50 μL 1 mol/L的氫氧化鈉，室溫放置5 min終止修飾，無水乙醇沉淀離心回收，室溫干燥后加入20 μL去RNA酶水重懸，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

十幾年后，在一個陰霾的秋日里，我跟一位司機開大卡車去給一個鎮(zhèn)子拉活兒。那是一個彌望郁然、有山有水的鎮(zhèn)子，鎮(zhèn)子被一層薄薄的流霧纏繞著。

③MTT檢測K562細胞抑制率 收集②中細胞，各孔吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，吸棄，加培養(yǎng)液180 μL，實驗終止前加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;控干液體，每孔加DMSO 150 μL，96孔振蕩板低速混勻10 min。酶標儀選擇波長490 nm，測定各組各孔吸光度A值。生長抑制率(IR)計算公式:IR(%)=(1－實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

①pcDNA3.1－h(huán)Per3質粒構建 hPer3質粒模板PCR產物經膠回收后，重組克隆到pcDNA3.1質粒，并對pcDNA3.1－h(huán)Per3質粒進行測序確認。

②脂質體介導的質粒轉染 pcDNA3.1－h(huán)Per3質粒參照試劑盒說明書經LipofectamineTM試劑盒轉染到K562細胞，設空載pcDNA3.1轉染組和空白對照組。轉染后分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h，每組設 6 復孔。

3.4 hPer3轉染K562細胞株

④Annexin V－FITC/PI雙染檢測凋亡 收集②中細胞，預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預冷的PBS，振蕩混勻上機檢測其凋亡率。

4 統計學處理

3.2.3 嚴格執(zhí)行消毒隔離 ①做好自我防護:戴手套操作;有創(chuàng)治療時戴護目鏡;嚴格執(zhí)行六步洗手法。②做好銳器傷防范:注射車上放置剪刀并固定，以便在床旁及時處理一次性醫(yī)療廢棄物;醫(yī)師、護士、保潔工熟知銳器傷后的處理和上報流程;推廣使用安全型留置靜脈注射器，保護患者靜脈、保證患者休息、減少銳器傷的發(fā)生。③所有操作嚴格均按標準預防技術操作原則進行。④教會患者家屬處理污物的方法，如接觸疑為血液、體液污染物品需戴手套給予處理并及時洗手，所有被體液污染物品按醫(yī)療廢棄物處理，防止發(fā)生院內外交叉感染的可能。

采用SPSS 13.0軟件，對 hPer3在 CML各階段和對照組的甲基化分布兩兩進行χ2檢驗(對1≤T＜5且n≥40采用校正χ2檢驗)，對CML各階段hPer3 mRNA表達做單因素方差分析和LSD－t檢驗，對K562轉染后固定時點的pcDNA3.1組和pcDNA3.1－h(huán)Per3組抑制率做t檢驗，對K562轉染后固定時點的對照組和 pcDNA3.1組、pcDNA3.1－h(huán)Per3組做單因素方差分析和LSD－t檢驗。

結 果

1 hPer3基因啟動子在CML各階段的甲基化分布

見圖1，對照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中，hPer3啟動子甲基化陽性率(例)分別為0%(0/40)、17.65%(3/17)、66.67%(4/6)和83.33%(5/6)。CML急變期和加速期甲基化陽性率均高于 CML慢性期，差異顯著(χ2=8.44，P ＜0.01;χ2=5.03，P ＜0.05)，但與 CML 急變期和加速期差異無顯著(P＞0.05);CML急變期、加速期和慢性期甲基化陽性率均高于對照組，差異顯著(χ2=29.29，P ＜0.01;χ2=21.41，P ＜0.01;χ2=4.33，P ＜0.05)。

Figure 1.hPer3 promoter methylation rates in IDA group and different phases of CML groups.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs IDA group;▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01 vs CML chronic phase group.圖1 hPer3基因啟動子在CML各階段和IDA組中的甲基化分布

2 CML各階段hPer3 mRNA表達

見圖2，對照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中hPer3 mRNA表達為75.03±18.16、5.13±2.29、0.40±0.18和0.17±0.05。各組兩兩之間差異顯著(P＜0.01)。

3 K562細胞株hPer3啟動子甲基化狀態(tài)

見圖2，K562細胞株中，hPer3啟動子為完全甲基化狀態(tài)，mRNA表達為0.05±0.03。

Figure 2.hPer3 promoter methylation status in K562 cells.M:methylation;U:unmethylation;m:marker;1:M.SssI;2:K562 cells;3:ddH2O.圖2 K562細胞中hPer3啟動子甲基化狀態(tài)

4 hPer3轉染K562細胞株

4.1 MTT檢測K562細胞抑制率 見圖3，24 h、48 h、72 h、96 h 各時點，pcDNA3.1 組抑制率分別為(1.3±0.3)%、(1.6±0.5)%、(1.3±0.5)%、(1.9±0.4)%;pcDNA3.1－h(huán)Per3組抑制率分別為(9.8±2.4)%、(29.1±5.1)%、(48.2±8.1)%、(63.4±10.5)%，各時點差異顯著(P＜0.01)。

Figure 3.Inhibitory rates of K562 cells detected by MTT.＊＊P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group.圖3 MTT檢測K562細胞抑制率

4.2 Annexin V－FITC/PI雙染檢測凋亡 圖4、5結果顯示，24 h、48 h、72 h、96 h 各時點，對照組凋亡率分別為(1.9±0.7)%、(2.6±0.8)%、(2.2±0.6)%、(2.8±0.9)%;pcDNA3.1組凋亡率分別為(2.4±0.8)%、(2.7±1.1)%、(2.5±1.1)%、(3.4±1.3)%;pcDNA3.1－h(huán)Per3組凋亡率分別為(7.4±2.3)%、(11.2±3.7)%、(16.9±4.5)%、(18.8±4.3)%。各時點pcDNA3.1－h(huán)Per3組凋亡率均高于對照組和pcDNA3.1組，差異顯著(P＜0.01)。

In this paper,the discriminator of the DLL is defined as:

Figure 4.Apoptotic rates of K562 cells in control group，pcDNA3.1 group and pcDNA3.1 － hPer3 group.＊＊ P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group or control group.圖4 各組早期凋亡率

Figure 5.Apoptotic rates of K562 cells detected by AnnexinV/PI staining.圖5 Annexin V－FITC/PI雙染檢測凋亡

討 論

CML的發(fā)病率僅次于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，慢粒經加速期轉入急變期過程中，約半數患者的轉變是逐漸發(fā)生的，但也有部分患者轉變迅速。國外有文獻認為，CML患者長期的酪氨酸激酶抑制劑治療引起CML患者骨髓白血病干細胞轉變?yōu)榫哂蓄~外特性的高級干細胞，這種高級干細胞引發(fā)了CML的急變并產生抗藥等不良后果［1］。CML慢性期出現進行性貧血、發(fā)熱持續(xù)不退、脾臟進行性腫大、出血傾向和骨骼疼痛、血象及骨髓象的改變等癥狀均預示有急變的可能。由于CML主要病因為BCR－ABL融合基因的產生，對CML緩解程度的分子生物學檢測多以BCR－ABL轉錄本水平進行判斷。但本研究顯示，hPer3的表達水平也可能作為慢粒急變的監(jiān)測指標之一，與Yang等［7］的研究結果基本一致。hPer3作為時鐘基因的一種，正常體內雖存在一定程度的振蕩，但在從CML慢性期進入加速期的變化幅度在1個數量級以上，遠高于正常體內的振蕩幅度［8］，可能作為慢粒急變的早期監(jiān)測指標之一。

可見,帶借代意義的詞,之所以獲得了借代意義,從源頭上看,是由于人們在認知事物的過程中,不同的詞涉及多個不同角度的關聯性所使然。這種不同的角度在語言系統中又是相互依存、相互關聯的,沒有主次分別。不過,就其關聯的事物的類別而言,同類關聯和異類關聯還是有著性質上的不同。也正因此,我們將這些不同的語義內在聯系方式區(qū)分為同類理據和異類理據。從探求理據的角度看,同類理據要比異類理據相對容易一些。

真核細胞基因表達調控途徑通常有轉錄水平調控、染色質結構調控、轉錄后水平調控、翻譯水平的調控等，啟動子區(qū)域甲基化屬于轉錄水平調控的一種，如果CpG島的甲基化為引起轉錄效率降低，那么其轉錄效率一般和甲基化程度存在相關性，如Na等［9］用甲基化特異性PCR和逆轉錄PCR觀察45例非小細胞肺癌患者GADD45家族基因啟動子甲基化和其 mRNA的關系，發(fā)現 GADD45A、GADD45B和GADD45G 分別有1.4%、7.2%和31.6%的甲基化比率，其中GADD45G mRNA降低與甲基化存在顯著相關。本研究發(fā)現，hPer3啟動子上的甲基化水平也隨著CML急變而升高，但在急變期和加速期間差異無顯著，可能和樣本例數過少有關，并且在慢粒細胞株K562中也觀察到了hPer3啟動子的完全甲基化狀態(tài)。因此CML中很可能是hPer3啟動子高甲基化導致了其基因的表達降低，某些去甲基化制劑5－雜氮－2'－脫氧胞苷誘導 MEG－01凋亡［10］可能和恢復hPer3的表達有關。Yang等［7］通過5－雜氮 －2'－脫氧胞苷逆轉了K562細胞中hPer3啟動子的高甲基化狀態(tài)并誘導hPer3基因重新表達，提示抑癌基因hPer3的激活可能是地西他濱治療惡性血液疾病的機制之一。我們通過轉染并在K562細胞中瞬時表達hPer3，發(fā)現K562呈現凋亡和生長抑制。有報道表明，hPer1參與了ATM－chk1/chk2的DNA損傷反應通路，并預示可能作為一種腫瘤抑制因子［11］，而孫成銘等［12］通過將hPer2轉染到K562細胞中觀察到cyclin B1的降低引起的 G2/M期阻滯［2］，這說明hPer3也可能通過類似機制作用于K562細胞，其表達缺失可能是慢粒表達的原因之一，但究竟hPer3的表達缺失是原發(fā)性還是繼發(fā)性引起的，值得進一步研究。

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