李尊嶺， 邵淑紅， 焦 飛， 岳 真， 李有杰

(濱州醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，分子遺傳學(xué)研究所，2應(yīng)用心理學(xué)教研室，山東 煙臺(tái) 264003)

ras基因家族主要有3個(gè)成員:K－ras、H－ras和 N －ras，分別定位于 12p1、11p15、1p22，其編碼的蛋白質(zhì)主要是高度保守的小G蛋白，該蛋白有188－189個(gè)氨基酸組成，定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，是控制細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵“開(kāi)關(guān)分子”［1］。Ras蛋白主要通過(guò)以下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞的增殖:表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)等信號(hào)分子與受體結(jié)合后，受體二聚化，激活其蛋白激酶的活性，使受體自身酪氨酸殘基磷酸化，形成SH2結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而結(jié)合接頭蛋白Grb2，活化SOS(son of sevenless)蛋白;活化的SOS蛋白結(jié)合Ras蛋白，使Ras蛋白釋放GDP，結(jié)合GTP，最終通過(guò)Ras/Raf和Rho/Rac通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡［2］。

K－ras基因的突變和過(guò)度表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切關(guān)系。有研究表明，在非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)尤其是腺癌中，60%的K－ras基因存在突變或過(guò)表達(dá)，主要是第12位密碼子中的鳥(niǎo)嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，從而導(dǎo)致 K－Ras蛋白喪失了GTP酶的活性，持續(xù)活化，使傳遞到細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器上的刺激大為延長(zhǎng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，發(fā)生癌變。已有報(bào)道表明肺腺癌細(xì)胞A549中存在 K－ras基因的突變［3］。研究表明早期肺腺癌中，K－ras基因突變患者的5年生存率比沒(méi)有基因突變患者的5年生存率明顯短。Suda等［4］發(fā)現(xiàn)在晚期肺腺癌患者中，K－ras基因突變患者的生存時(shí)間明顯短于無(wú)突變患者。以上資料表明:K－ras基因在肺腺癌中突變或過(guò)表達(dá)是一個(gè)大概率事件;無(wú)論是早期還是晚期肺癌患者，K－ras基因突變或過(guò)度表達(dá)，都能顯著降低病人的5年生存率。

本研究檢測(cè)了K－Ras蛋白在6例肺腺癌標(biāo)本、正常毗鄰肺組織和 A549細(xì)胞中的表達(dá)，以驗(yàn)證K－ras基因在肺腺癌中高表達(dá)的結(jié)論。另外，我們構(gòu)建了K－ras的反義表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡情況，并檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白細(xì)胞周期素A(cyclin A)、細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期素E(cyclin E)、細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶2(cyclin－dependent kinase 2，CDK2)和細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶4(cyclin－dependent kinase 4，CDK4)，以及凋亡相關(guān)蛋白caspase－3、P53和Rb的表達(dá)，旨在探討K－ras反義核酸在肺癌基因治療中的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞及試劑

本研究所用的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)載體由本研究所保存。6例肺腺癌標(biāo)本和毗鄰組織由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清由HyClone提供?？笴aspase－3、P53、Rb、cyclin A、cyclin D1、K － Ras抗體由 Santa Cruz Biotechnology提供，抗 cyclin E、CDK 2和CDK4抗體由 Cell Signaling Technology提供。K－ras反義寡核苷酸引物由北京賽百盛生物科技有限公司合成。T4 DNA連接酶、EcoR I內(nèi)切酶和Hind III內(nèi)切酶均購(gòu)自Fermentas，膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000 reagent kit購(gòu)自Invitrigen，Annexin V試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理)、空載體組(僅轉(zhuǎn)染了載體質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染了K－ras反義表達(dá)載體)。

2.2 K－ras反義表達(dá)載體的構(gòu)建 以人 K－ras基因(NM－004985)exon 1為模板，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)該基因的特異引物，序列為上游5＇－ GCGGAATTCCGGCTCGGCCAGTACTCC －3＇(下劃線(xiàn)為EcoR I酶切位點(diǎn))，下游5＇－ GCGAAGCTTCTCTTGCCTACGCCACCA －3＇(擴(kuò)展片段大小為 200 bp，下劃線(xiàn)為Hind III酶切位點(diǎn))。應(yīng)用DNA提取試劑盒(TaKaRa生物工程有限公司)，從肺腺癌細(xì)胞A549中提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增K－ras反義片段，條件為:95℃ 5 min預(yù)變性后，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃ 10 min。將擴(kuò)增后的目的片段和pcDNA3.1(+)載體應(yīng)用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切體系為:K－ras片段或pcDNA3.1(+)載體10 μL、10 × buffer R 2 μL、EcoR I和Hind III各2 μL、雙蒸水 4 μL，總體系為20 μL，37 ℃孵育6 h。膠回收試劑盒回收目的片段(按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，具體操作如下:pcDNA3.1(+)載體片段0.5 μL、K－ras目的片段1 μL、T4 DNA 連接酶 1 μL，10 × buffer 1 μL、雙蒸水6.5 μL，總體系 10 μL，22 ℃孵育 5 h。對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行電泳和PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆，并測(cè)序(北京拜爾特普生物技術(shù)有限公司完成)驗(yàn)證連接的正確性［5］(命名為 antisense－ K －ras－pcDNA3.1)。

2.3 轉(zhuǎn)染 詳細(xì)操作步驟按照Lipofectamine 2000 reagent kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 MTT測(cè)細(xì)胞增殖情況 取96孔板，接種1×104個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染96h后，PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加0.1 mL PBS和10 μL MTT染液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。

2.5 Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染96 h后，PBS洗滌2次，應(yīng)用binding buffer結(jié)合并懸浮細(xì)胞，加入1 μL Annexin V－FITC混勻后加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)進(jìn)行標(biāo)記，室溫避光反應(yīng)5 min，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.6 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞總蛋白應(yīng)用細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行提取，超聲10 s，12000 r/min離心20 min收集上清。應(yīng)用Bradford試劑盒進(jìn)行蛋白定量，等量的細(xì)胞總蛋白(每個(gè)泳道80 μg)應(yīng)用10%的SDS－PAGE膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交，Ⅰ抗應(yīng)用兔抗 caspase－3、P53、Rb和鼠抗 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4 抗體，Ⅱ抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體，ECL熒光試劑盒進(jìn)行曝光、顯影、定影、壓片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以目的蛋白和GAPDH吸光度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 K－ras反義核酸表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究應(yīng)用PCR的方法，擴(kuò)增K－ras exon 1反義片段，電泳后在200 bp顯示有一條帶，見(jiàn)圖1，與目的片段大小相吻合，表明 K－ras exon 1反義片段擴(kuò)增正確(測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了證實(shí))。應(yīng)用EcoR I和Hind III對(duì)空白載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行雙酶切，電泳后在4000 bp顯示單一條帶，且條帶整齊，無(wú)彌散和多條帶現(xiàn)象，表明成功對(duì)pcDNA3.1(+)空白載體進(jìn)行了雙酶切，見(jiàn)圖1。應(yīng)用膠回收試劑盒對(duì)以上 K－ras exon 1反義片段和pcDNA3.1(+)雙酶切片段進(jìn)行回收，電泳結(jié)果顯示在200 bp和4000 bp各有一整齊條帶，表明片段回收正確，在回收過(guò)程中無(wú)條帶斷裂等現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。應(yīng)用T4 DNA連接酶對(duì)以上回收的目的片段進(jìn)行連接，由于電泳的方法較難區(qū)分4000 bp和4200 bp條帶，本實(shí)驗(yàn)采用菌落PCR的方法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性克隆菌落組電泳結(jié)果顯示在200 bp有一整齊條帶，而陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果沒(méi)有任何條帶，見(jiàn)圖1，表明成功構(gòu)建了K－ras exon 1的反義表達(dá)載體(測(cè)序證實(shí)了該結(jié)果的正確性)。

Figure 1.The construction of antisense K－ras exon 1 expression vector.M:marker;1:the fragment of K －ras exon 1 and its length was 200 bp;2:the fragment of pcDNA3.1(+)vector digested by EcoR I and Hind III;3:the purification result of digested pcDNA3.1(+)vector;4:the purification result of digested K－ras exon 1;5:negative control that the template was the pcDNA3.1(+)vector;6:positive result that its sequence was identified.圖1 K－ras exon 1反義表達(dá)載體的構(gòu)建

2 K－Ras蛋白在肺腺癌標(biāo)本和A549細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)6例肺腺癌標(biāo)本、毗鄰正常組織和A549細(xì)胞中K－Ras蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與正常毗鄰組織相比較，6例標(biāo)本中有4例標(biāo)本K－Ras蛋白高表達(dá)，陽(yáng)性率為66.7%;在A549細(xì)胞中，K－ras蛋白高表達(dá)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of K－Ras in lung samples and A549 cells.A:A549 cells and lung adenocarcinoma samples(S1 －S6);B:paired adjacent normal samples.圖2 K－Ras蛋白在肺標(biāo)本和A549細(xì)胞中的表達(dá)

3 反義核酸抑制K－Ras蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染96 h后，各組細(xì)胞中 K－Ras蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示antisense－K－ras－pcDNA3.1能夠明顯抑制K－ras基因的表達(dá)，抑制率可以高達(dá)70%，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The expression of K －Ras in different groups.1:A549 cells;2:A549 cells transfected by pcDNA3.1;3:A549 cells transfected by antisense－ K－raspcDNA3.1.圖3 K－Ras蛋白在不同實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)

4 Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的 A549細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為發(fā)紅色熒光的細(xì)胞明顯增多，見(jiàn)圖4。

5 MTT測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

在細(xì)胞培養(yǎng)的前3 d，細(xì)胞生長(zhǎng)未見(jiàn)明顯差異。從第4 d開(kāi)始，轉(zhuǎn)染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The apoptosis among different groups(× 400).A:A549 cells;B:A549 cells transfected by pcDNA3.1(+);C:A549 cells transfected by antisense－ K －ras－pcDNA3.1.圖4 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡

Figure 5.The growth curves in different groups..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

6 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組和空載體組相比較，轉(zhuǎn)染反義K－ras的細(xì)胞中 G1/S期相關(guān)蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4的表達(dá)明顯降低(均 P＜0.05)。抑癌蛋白 Rb、P53和凋亡相關(guān)蛋白caspase－3的表達(dá)明顯升高(均P＜0.01)，而空載體組和空白組，上述蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖6。

討 論

Figure 6.The expression of cyclin A，cyclin D1，cyclin E，CDK2，CDK4，Rb，P53 and caspase－3.1:control;2:pcDNA3.1(+);3:antisense－K－ras－pcDNA3.1..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖6 各目的蛋白的表達(dá)分析

反義核酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理用人工合成或生物體合成的特定DNA或RNA片段抑制或封閉基因表達(dá)的技術(shù)。根據(jù)核酸雜交原理，反義核酸可以從基因表達(dá)調(diào)控的多個(gè)層次干擾基因表達(dá)，最主要的作用靶點(diǎn)是在轉(zhuǎn)錄和翻譯起始階段的調(diào)控，最終抑制靶基因的表達(dá)，達(dá)到治療和預(yù)防某些疾病的目的。目前，反義核酸療法已在腫瘤學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，有些已經(jīng)進(jìn)入了實(shí)驗(yàn)和臨床階段，主要靶基因集中于癌基因和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等領(lǐng)域［6］。

K－ras基因是最早發(fā)現(xiàn)的癌基因之一，其編碼的蛋白質(zhì)是小G蛋白，結(jié)合GTP后被激活，水解GTP后活性喪失，是酪氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子。目前，利用反義核酸技術(shù)封閉 K－ras基因表達(dá)的研究已經(jīng)滲透到癌癥研究的各個(gè)領(lǐng)域在肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌等多個(gè)癌癥領(lǐng)域，都有反義K－ras抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的報(bào)道。有研究表明［7］，利用反義核酸技術(shù)，針對(duì) K －ras基因第2、第3外顯子以及兩側(cè)2.0 kb的核酸序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義核酸，轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞H460后，K－ras基因表達(dá)的抑制可以高達(dá)90%以上，而且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，癌細(xì)胞喪失了致瘤能力。還有研究［8］利用 K－ras反義核酸封閉K－ras基因表達(dá)后，能夠明顯抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和裸鼠致瘤能力，而且相同的結(jié)果也出現(xiàn)在胃癌細(xì)胞的研究中，但是反義 K－ras抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制報(bào)道較少。

本研究6例肺腺癌標(biāo)本中，有4例高表達(dá)KRas，陽(yáng)性率為66.7%，而且在A549細(xì)胞中 K－Ras蛋白高表達(dá)，驗(yàn)證了文獻(xiàn)報(bào)道中K－Ras蛋白在肺腺癌中高表達(dá)的結(jié)論，為接下來(lái)的研究奠定了基礎(chǔ)。接著，本研究利用反義核酸技術(shù)，針對(duì)K－ras基因exon 1，設(shè)計(jì)了反義核酸引物序列，并進(jìn)行硫代化修飾，構(gòu)建了針對(duì)K－ras的反義核酸表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染肺腺癌A549后，Western blotting檢測(cè)K－Ras蛋白的表達(dá)，從中選出了抑制作用最強(qiáng)的一條反義核酸;轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡較明顯，而且細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，表明封閉 K－ras基因表達(dá)后，能夠抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

另外，在轉(zhuǎn)染反義 K－ras的細(xì)胞中，G1/S期相關(guān)蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2 和 CDK4的表顯著降低，而抑癌蛋白R(shí)b、P53以及凋亡蛋白caspase－3的表達(dá)明顯升高，表明封閉 K－ras基因表達(dá)后，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行和DNA合成的相關(guān)蛋白表達(dá)降低，而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)增加。

在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，cyclin和CDK形成復(fù)合物調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)行。CyclinD1/CDK4和cyclin E/CDK2形成復(fù)合物后，促進(jìn)了細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，而cyclin A/CDK2形成復(fù)合物后，促進(jìn)了S期中DNA合成的起始［9］。Rb蛋白是一個(gè)抑癌蛋白，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，使細(xì)胞停滯在G1期;p53是目前發(fā)現(xiàn)的最經(jīng)典的抑癌基因，在DNA損傷修復(fù)和促進(jìn)凋亡方面發(fā)揮著重要作用。Caspase－3是促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，發(fā)揮著重要作用［10］。

Cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2復(fù)合物形成后，使Rb蛋白磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，游離的E2F又可以促進(jìn)其自身、cyclin D、CDK2和cyclin E等的合成，進(jìn)一步促進(jìn)Rb蛋白的磷酸化，釋放更多的E2F，形成一種正反饋，最終促進(jìn)DNA的合成，使細(xì)胞順利通過(guò)G1/S期轉(zhuǎn)折點(diǎn)［11］。在這個(gè)過(guò)程中cyclin A與CDK2形成復(fù)合物促進(jìn)了DNA復(fù)制的起始，啟動(dòng)DNA的復(fù)制。P53蛋白通過(guò)促進(jìn)G1期特異的細(xì)胞周期抑制物p21蛋白和DNA損傷修復(fù)誘導(dǎo)蛋白Gadd 45的表達(dá)，使DNA受損細(xì)胞不再分裂，細(xì)胞停留在 G1期［12］。

綜上所述，K－ras基因反義核酸能抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4 的表達(dá)降低和caspase－3、P53、Rb的表達(dá)升高有關(guān)。

［1］Younes N，F(xiàn)ulton N，Tanaka R，et al.The presense of K－12 ras mutations in duodenal adenocarcinomas and the absence of ras mutations in other small bowel adenocarcinomas and carcinoid tumors［J］.Cancer，1997，79(9):1804－1808.

［2］Ma P，Magut M，F(xiàn)aller DV，et al.The role of Ras in T lymphocyte activation ［J］.Cell Signal，2002，14(10):849－859.

［3］王啟釗，刁 勇，呂穎慧，等.突變型 K－ras siRNA抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009，16(6):564－569.

［4］Suda K，Tomizawa K，Mitsudomi T.Biological and clinical significance of KRAS mutations in lung cancer:an oncogenic driver that contrasts with EGFR mutation［J］.Cancer Metastasis Rev，2010，29(1):49 －60.

［5］李尊嶺，邵淑紅，謝書(shū)陽(yáng)，等.CyclinD1反義核酸誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549的凋亡［J］.生理學(xué)報(bào)，2011，63(3):261－266.

［6］Lozano MD，Zulueta JJ，Echeveste JI，et al.Assessment of epidermal growth factor receptor and K－ras mutation status in cytological stained smears of non－small cell lung cancer patients:correlation with clinical outcomes［J］.Oncologist，2011，16(6):877 －885.

［7］Findeiss S，Schmidtke C，Stadler PF，et al.A novel family of plasmid－transferred anti－sense ncRNAs［J］.RNA Biol，2010，7(2):120 －124.

［8］Dancey JE.Agents targeting ras signaling pathway［J］.Curr Pharm Des，2002，8(25):2259 －2267.

［9］Akli S，Keyomarsi K.Cyclin E and its low molecular weight forms in human cancer and as targets for cancer therapy［J］.Cancer Biol Ther，2003，2(4 Suppl 1):S38－S47.

［10］葉 孟，林 蕾，潘宏銘，等.Caspase 3抑制劑羥基喜樹(shù)堿對(duì)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞 NF－κB的激活［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23(8):1508 －1511.

［11］劉 娟，殷 飛，姚樹(shù)坤.細(xì)胞周期素D1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的意義［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(2):304 －309.

［12］Shih RS，Wong SH，Schoene NW，et al. Enhanced Gadd45 expression and delayed G2/M progression are p53－dependent in zinc－supplemented human bronchial epithelial cells［J］.Exp Biol Med，2010，235(8):932 －940.