安麗萍 劉曉梅 王春梅 詹巾卓 孫 匯 李 娜 王 拓 杜培革 孫志偉

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春 130021)

胰島β細(xì)胞的凋亡與糖尿病發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。在2型糖尿病(T2DM)自然病程中，不管采用目前的何種治療方案，β細(xì)胞功能都呈進(jìn)行性受損〔1〕。保護(hù)β細(xì)胞、緩解β細(xì)胞功能減退是T2DM治療的關(guān)鍵。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是T2DM的作用靶點(diǎn)。天然GLP-1很不穩(wěn)定，可迅速被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)剪切掉N末端氨基酸而降解，半衰期很短，僅1～2 min，這限制了其臨床應(yīng)用。艾塞那肽(Exenatide)是GLP-1的類似物，與GLP-1有53%同源性，但不易被DPPⅣ降解，可延長作用時(shí)間以適應(yīng)治療的需要。研究證明:Exenatide不但能明顯改善T2DM動(dòng)物模型血糖的控制情況，還可刺激胰島β細(xì)胞數(shù)增加量〔2〕。但其具體的機(jī)制尚不清楚。本研究從凋亡的角度，利用體外培養(yǎng)的胰島細(xì)胞RINm5f，探討Exenatide對(duì)于游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡是否具有抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胰島細(xì)胞株RINm5f購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。Exenatide購于吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院。軟脂酸、MTT為Sigma公司產(chǎn)品。凋亡試劑盒為BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RINm5f細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代，每2天換液一次。

1.2.2 軟脂酸損傷大鼠胰島細(xì)胞株RINm5f模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/ml，每孔200 μl接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)平行孔。將軟脂酸儲(chǔ)存液用1640培養(yǎng)基稀釋成250、500 μmol/L 濃度，培養(yǎng)細(xì)胞 24 ～48 h，MTT 檢測(cè)細(xì)胞存活率，建立軟脂酸損傷RINm5f模型。為除外不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞生長的影響，各組細(xì)胞培養(yǎng)液中牛血清白蛋白的最終濃度均為0.45%。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將細(xì)胞懸液按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)使細(xì)胞貼壁。換含不同濃度軟脂酸培養(yǎng)基或含不同濃度軟脂酸+Exenatide培養(yǎng)基(軟脂酸及Exenatide儲(chǔ)存液分別用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組。每組設(shè)6個(gè)平行孔，每孔加培養(yǎng)液200 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。每孔加入 MTT溶液20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸出上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光值(OD)，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4 AO/EB雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為6×104/ml，每孔1 ml接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，換成含不同濃度Exenatide與250 μmol/L軟脂酸的培養(yǎng)液，使Exenatide的終濃度分別為0.1、1、10 nmol/L，每個(gè)濃度組3個(gè)平行樣，分別培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，0.01 mol/L PBS洗細(xì)胞，1 500 r/min離心 10 min，棄上清，100 μl PBS懸浮細(xì)胞，加4 μl AO/EB混合染液(1%AO，以生理鹽水配制;5 mg/ml EB，以蒸餾水配制。用時(shí) AO∶EB∶PBS=1∶2∶97)，輕輕混勻，染色1 min后，取細(xì)胞懸液10 μl滴在潔凈的玻片上，蓋玻片封固后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用FITC-AnnexinV/PI雙熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×105/ml，每孔3.0×105接種6孔板中，細(xì)胞貼壁后換成含不同濃度 Exenatide(0.1、1、10 nmol/L)與 250 μmol/L軟脂酸的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度3個(gè)平行樣，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用 PBS洗2次，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml，取 1 ml，離心棄上清，加入 Binding Buffer 195 μl、FITC標(biāo)記的Annexin V抗體5 μl，常溫避光放置20 min，PBS洗2次，加入 Binding Buffer 190 μl、PI 10 μl，4℃、15 min 避光保存，用流式細(xì)胞儀收集1×104個(gè)細(xì)胞，Cellquest軟件分析結(jié)果，結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 Exenatide對(duì)大鼠胰島細(xì)胞株RINm5f細(xì)胞存活率影響采用MTT法檢測(cè)Exenatide處理24、48 h對(duì) RINm5f存活率的影響。結(jié)果如圖1所示，24 h對(duì)照組吸光度值為0.895±0.03，而 Exenatide組(Exenatide濃度分別為 0.1、1、10 nmol/L)吸光度值分別為0.89±0.05，0.90±1.1，0.97±0.06。48 h對(duì)照組吸光度值為1.11±0.08，而各濃度Exenatide組分別為0.97±0.07，1.1±0.02，1.38 ±0.08。可見，Exenatide對(duì)大鼠胰島細(xì)胞株RINm5f的促增殖作用呈時(shí)間和劑量依賴性。

2.2 Exenatide對(duì)軟脂酸培養(yǎng)的RINm5f存活率的影響 采用0.25 mmol/L軟脂酸處理RINm5f 24 h建立RINm5f損傷模型。Exenatide 0.1、1、10 nmol/L 預(yù)處理24 h，MTT 法檢測(cè)Exenatide對(duì)RINm5f存活率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軟脂酸0.25 mmol/L培養(yǎng)RINm5f 48 h，與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率降至(53.83±7.6)%;同時(shí)應(yīng)用 Exenatide 0.1、1、10 nmol/L治療，細(xì)胞存活率分別為(63.31±5.26)%，(65.03±5.13)%，(66.7±3.1)%。

2.3 胰島細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 在激光共聚焦顯微鏡下，正常胰島細(xì)胞核DNA呈黃色或黃綠色的均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA為橘黃色或橘紅色熒光。凋亡早期細(xì)胞，細(xì)胞核較小，固縮呈較濃的黃綠色，或呈半月形，甚至為黃綠色碎塊，可見凋亡小體。而凋亡晚期已死亡的細(xì)胞，具有凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征，DNA被EB染成紅色。壞死細(xì)胞無凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化，但胞核染成紅色，并且胞漿也染成紅色，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清或溶解。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組很少見到凋亡細(xì)胞;0.25 mol/L軟脂酸組見較多凋亡細(xì)胞，還可見到較多壞死細(xì)胞;而在Exenatide組與單純軟脂酸組比較較少見凋亡細(xì)胞。見圖1。

2.4 流式細(xì)胞術(shù) 采用FITC-AnnexinV/PI雙熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)觀察RINm5f細(xì)胞凋亡變化。Exenatide治療組凋亡率明顯低于軟脂酸組，并呈劑量依賴性。見表1。

表1 軟脂酸誘導(dǎo)的RINm5f細(xì)胞凋亡率(，%，n=3)

表1 軟脂酸誘導(dǎo)的RINm5f細(xì)胞凋亡率(，%，n=3)

與軟脂酸組比較:1)P＜0.05

13.07±1.64 3.12±0.15 16.187±1.78軟脂酸組 7.65±1.1 47.1±1.8 54.75±0.82 Exenatide 10 nmol/L組16.57±3.741) 6.1±2.831) 22.67±6.441)Exenatide 1 nmol/L組16.17±1.721)15.13±6.971) 31.3±6.161)Exenatide 0.1 nmol/L組________組別 早期凋亡 晚期凋亡 總凋亡對(duì)照組15.7±2.5_______25.33±4.22 41.03±2.87

圖1 胰島細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

糖尿病與非糖尿病患者的β細(xì)胞復(fù)制和新生并沒有顯著差異，只是凋亡率顯著升高〔3〕。凋亡在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中顯得尤為重要。軟脂酸是一種16-碳飽和脂肪酸，是脂肪酸的主要成分，在高脂肪酸損傷胰島細(xì)胞功能過程中扮演重要角色。軟脂酸可以自由出入胰島細(xì)胞膜，導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能障礙和凋亡。

本研究可見胰島細(xì)胞存活率下降，凋亡率升高，大部分細(xì)胞凋亡，還有部分壞死細(xì)胞。有研究證明了軟脂酸誘導(dǎo)的這種“脂性凋亡”是由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的。而Exenatide治療組與對(duì)照組比較，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制軟脂酸刺激的胰島細(xì)胞的凋亡，并隨著劑量的增加總凋亡率下降，尤其是晚期凋亡率，可以阻止早期凋亡細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

Exenatide是GLP-1受體激動(dòng)劑，具有與GLP-1相似的生物學(xué)活性，與GLP-1受體具有高度親和力;其與GLP-1受體結(jié)合后可引起胞內(nèi)cAMP升高，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路〔4〕，從而發(fā)揮抗凋亡作用，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1 Butler AE，Janson J，Bonner-Weir S，et al.Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2003;52:102-10.

2 Rolin B，Larsen MO，Goffredsen CF，et al.The long-acting GLP-1 derivative NN2211 ameliorates glycemia and inerease beta-cellⅡlass in diabetic miee〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002;283:E745-52.

3 Rhodes CJ.Type 2 diabetes-amatter of b-cell life and death〔J〕.Science，2005;307(5708):380-4.

4 Gier B，Matveyenko AV，Dawson DW，et al.GLP-1 receptor activation by exenatide induces expansion of pancreatic duct glands〔J〕.Endocrinol Rev，2011;32:481-5.