褚文政 王曉彤 佴 玉 于國平 錢采韻

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓磺頂醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 煙臺 264000)

散發(fā)性阿爾茨海默病(Sporadic Alzheimer's disease，SAD)的病因及發(fā)病機(jī)制至今不清，通常認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。早期的腦葡萄糖代謝異常與癡呆癥狀明顯相關(guān)。神經(jīng)元的糖代謝異常歸因于胰島素/胰島素受體(insulin/insulin receptor，I/IR)信號系統(tǒng)功能紊亂，ATP減少和I/IR功能紊亂均與β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)側(cè)腦室注射(intracerebroventricular injection，icv)可導(dǎo)致腦內(nèi)胰島素受體磷酸化能力及內(nèi)在酪氨酸激酶活性下降，從而引起I/IR轉(zhuǎn)導(dǎo)功能紊亂，進(jìn)一步引起腦內(nèi)葡萄糖代謝功能障礙及其他與SAD類似的病理變化。本研究試圖驗(yàn)證側(cè)腦室注射STZ后是否可導(dǎo)致腦內(nèi)能量減少及tau蛋白磷酸化增多等與SAD相似的病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和分組 成年雄性SD大鼠44只，體重250～320 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按隨機(jī)數(shù)字表法分為STZ組和生理鹽水(NS)組，每組22只。每只動(dòng)物術(shù)前、術(shù)后第10、21天分別用快速血糖儀測尾靜脈血糖，術(shù)前，術(shù)后無差別。

1.1.2 主要試劑 STZ(美國Introvengen公司);ATP酶檢測試劑盒(南京建成公司)。5'-ATP鈉鹽(美國 Sigma公司)。tau-PSer202，tau-PSer396(美國 Biosource 公司)，tau-PSer404(美國Santa Cruz公司)。Western印跡試劑盒(美國 Roche公司)。SABC顯色試劑盒(福建邁新公司)。

1.1.3 主要儀器 大鼠腦立體定向儀(SN3日本);微量注射儀，微量血糖儀(美國強(qiáng)生公司);液相色譜儀(美國Water公司)。電泳儀及圖像采集分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。紫外分光光度儀:UV-120-02型(日本津島公司);JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像攝錄輸入儀(日本)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，固定于SN3型腦立體定向儀。常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。微量注射器每側(cè)側(cè)腦室注射STZ 10 μl(約3 mg/kg，注射前將STZ溶于生理鹽水，濃度10%)。坐標(biāo)參照文獻(xiàn)〔1〕:前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm。第3天重復(fù)注射，劑量同前。對照組以等量NS代替STZ，其余操作相同。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

1.2.2 高效液相法檢測大鼠腦海馬區(qū)ATP含量 分別取STZ組和NS組大鼠各8只，麻醉取腦，冰上分離海馬，每50 mg加入0.5 ml高氯酸，冰上勻漿，取上清，4℃離心10 000 r/min，5 min，再取上清，0.5 mol/ml氫氧化鈉調(diào)pH至7.6～7.8;低溫離心5 min，上清液氮保存，分析前取出解凍，20 μl上樣。色譜條件:色譜柱:hypersil液相色譜柱(BDSC)18不銹鋼柱(5 μm，ID4.6×30 cm);流動(dòng)相:150 mmol/L磷酸二氫鉀(pH6.45)，流速0.8 ml/min;紫外檢測波長為254 nm;色譜行為:保留時(shí)間約17 min;標(biāo)準(zhǔn)曲線:ATP 2.2 ～ 55 μg/ml，Y=29 246.2X-18 246.2，r=0.999 7。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測海馬 tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá) 建模后21 d，分別取STZ組和NS組大鼠各8只，常規(guī)麻醉，灌注，取腦，連續(xù)冰凍切片，片厚5 μm。行SABC免疫組織化學(xué)檢查，一抗為兔抗大鼠1∶100 tau-PS-er202、1∶200 tau-PSer396、1∶100 tau-PSer404。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽性細(xì)胞呈棕黃色。

1.2.4 Western印 跡 檢 測 海 馬 tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404表達(dá) 取STZ組大鼠和NS組大鼠各6只，麻醉，斷頭取腦，冰上分離海馬，估計(jì)體積，加入2倍體積的預(yù)冷細(xì)胞裂解液，4℃離心，測蛋白濃度(Bradford法檢測)，將上清液蛋白濃度調(diào)整為2.5 μg/μl。樣品變性后，于8%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上樣，每孔上樣 20 μl及 Marker 8 μl，4℃過夜。將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后，加入兔抗大鼠 tau-PSer202(1∶6 000)、tau-PSer396(1∶4 000)和 tau-PSer404(1∶800)抗體，4℃過夜。以 β-actin(1∶3 000)作內(nèi)參照。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG1∶2 000，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素1∶1 000，室溫輕搖40 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色。暗室中用X感光膠片曝光10 s～5 min，顯影1 min，定影3 min。根據(jù)發(fā)光的速度和強(qiáng)度，適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，晾干后觀片、拍照。應(yīng)用AlphaImager 2200計(jì)算機(jī)全自動(dòng)圖像分析軟件測量曝光后 X膠片上 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404顯色條帶的面積(AREA)和平均光密度值(AVG)，獲得光密度值積分(IDV=AREA×AVG)，分別取 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404的IDV值與內(nèi)參照β-actin的IDV值比較，即得到其蛋白表達(dá)的相對百分含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，組間差異比較應(yīng)用t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組ATP含量的比較 STZ組和NS組海馬區(qū)ATP含量比較有顯著性差異〔(4.33±1.70)vs(8.62±3.11)，P＜0.05〕。

2.2 海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)STZ組和NS組分別取相同部位切片，計(jì)數(shù)每張切片海馬區(qū)相近部位隨機(jī)5個(gè)視野(10×20)下陽性細(xì)胞平均數(shù)。STZ組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞數(shù)較NS組明顯增多，著色位于胞體與突起交接處及軸突處明顯，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。NS組大鼠腦內(nèi)很少 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞。經(jīng)Alpha imager 2200圖像分析軟件計(jì)數(shù)，差別有顯著意義(P＜0.05)。提示側(cè)腦室注射STZ后可引起tau蛋白在這3個(gè)Ser位點(diǎn)上的的磷酸化增多。見表1，圖1。

2.3 海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404蛋白含量檢測

STZ組tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404在海馬部位表達(dá)明顯增多，NS組也有少量表達(dá)，兩者相對含量比較有顯著差別(P＜0.05)。多克隆抗體且tau蛋白存在異構(gòu)體，在SDS凝膠上可表現(xiàn)2條或2條以上相近條帶，分子量約55～65 kD。見表2，圖2。

表1 兩組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(，n=8)

表1 兩組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(，n=8)

與NS組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 tau-PSer202 tau-PSer396 tau-PSer404 STZ組 152.53±72.1 261.6±52.61) 155.14±118.11)4.95±2.67 4.05±1.85 5.55±3.28 NS組

圖1 STZ和NS組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(DAB染色，×400)

表2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404相對含量(，n=6)

表2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404相對含量(，n=6)

組別 tau-PSer202 tau-PSer396 tau-PSer 404 STZ組 21.9±6.931) 30.62±3.831) 45.50±8.6121)NS組0.722±0.39 8.18±3.27 17.9±7.85

圖2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404蛋白Western印跡表達(dá)結(jié)果

3 討論

阿爾茨海默病(AD)患者腦葡萄糖代謝和細(xì)胞能量產(chǎn)生明顯受損〔3〕。在SAD初期，葡萄糖代謝紊亂引起 ATP減少約50%，并隨病程進(jìn)展而加重;而ATP對于維持大部分細(xì)胞和分子水平功能至關(guān)重要〔4〕，ATP減少可使細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，膜對離子通透性改變，甚至造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，神經(jīng)細(xì)胞變性或興奮性傳遞受影響，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及壞死〔5～7〕。伴隨ATP的減少，細(xì)胞線粒體受損嚴(yán)重，線粒體氧化磷酸化功能下降〔5，8〕。

在胎腦中tau蛋白約有6～8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在成人腦中約有2～3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其磷酸化水平可受發(fā)育調(diào)節(jié)。某些病理情況下tau蛋白可以異常磷酸化〔9〕。過度磷酸化的tau蛋白促進(jìn)微管蛋白聚集和組裝能力降低，導(dǎo)致微管穩(wěn)定性下降，影響胞體和軸突間的細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步影響細(xì)胞功能或?qū)е录?xì)胞死亡。tau蛋白在色氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)上的磷酸化受幾種蛋白激酶和蛋白磷酸脂酶調(diào)控。促使tau蛋白磷酸化的激酶中包括ATP-dependent胰激肽原酶(PK)erk36和PKerk40、糖原合成激酶(GSK)-3β 和3α，都是受 I/IR 系統(tǒng)控制的〔10〕。ATP減少也可以激活PKerk36和PKerk40〔11〕;I/IR系統(tǒng)缺陷可以激活 GSK-3β活性，均可引起 tau 的磷酸化〔9，10，12，13〕。tau 蛋白可有多種異構(gòu)體，通過不同的mRNA剪接而產(chǎn)生，模擬分子量約55～62 kD。

本文STZ組大鼠21 d后經(jīng)免疫組化檢測海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性表達(dá)均比NS組明顯，染色位于胞質(zhì)及胞體與突觸結(jié)合處和軸突明顯。經(jīng)Western印跡檢測兩組海馬tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404含量也有顯著性差異。提示了STZ側(cè)腦室注射后可能通過干擾I/IR系統(tǒng)，導(dǎo)致一些控制tau蛋白磷酸化和去磷酸化的酶活性變化，以及ATP的減少都可以促進(jìn)tau的異常磷酸化。Hong等〔10〕在細(xì)胞水平已經(jīng)證實(shí)I/IR系統(tǒng)可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(PIK-3)途徑抑制GSK-3β而調(diào)控tau蛋白的磷酸化水平。本文從大體模型證實(shí)用STZ干擾I/IR系統(tǒng)也可以導(dǎo)致tau蛋白的異常磷酸化，進(jìn)一步提示I/IR系統(tǒng)功能紊亂在SAD發(fā)病中可能發(fā)揮了一定作用。

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