李志丹 曲曉峰 婁長芹 (北華大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 吉林 30)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心肌對多種疾病包括高血壓、負荷增加、心肌梗死、心律失常的適應性反應，是心輸出量增加的代償性反應，但持續(xù)MF能引起心室壁僵硬、心臟順應性降低、心室舒張功能障礙。MF是心血管疾病病死率和發(fā)病率的獨立危險因素。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能夠誘導人體補體因子B(CFb)的增殖及其膠原合成，在肥厚型心肌病的病理損害中起重要作用。依那普利(Ena)在臨床上用于治療高血壓、心肌肥厚、心力衰竭等疾病。近年發(fā)現(xiàn)其具有抗MF作用〔1〕，但對其機制研究較少。本實驗通過觀察Ena抗AngⅡ/異丙腎上腺素(Iso)誘導大鼠CFb增殖及纖維化作用，觀察其對膠原合成及形態(tài)學指標的影響，探討其在抗MF中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 實驗動物:出生1～3 d的新生乳鼠和60只體重200～220 g Wistar大鼠，雌雄不限，本校實驗動物中心提供;胰蛋白酶:寶泰克生物試劑;AngⅡ:Sigma;Iso:批號3E0002，濟南科匯制藥有限公司;四氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒:南京建成生物公司;Ena購自江蘇常州制藥廠，批號0601151;IMDM培養(yǎng)基:HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS):常州四季青;Heraeus型CO2培養(yǎng)箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動酶聯(lián)檢測儀;日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 CFb原代培養(yǎng)及鑒定 出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集細胞，置于含100 ml/L FCs的IMDM培養(yǎng)液中，在50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)60～90 min。采用差速貼壁法分離CFb，加入含100 ml/L FCs的IMDM繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)鑒定為所需的CFb，純度達98%，生長近融合時按1∶3傳代，實驗采用2～4代細胞。

1.2.2 分組及給藥 分為五組，對照組，AngⅡ組(AngⅡ10-7mol/L);Ena(10-7，10-6，10-5mol/L)三個劑量組。參照Rona等方法，模型組和各給藥組首次背部皮下注射 Iso 20.0 mg/kg，第二日背部皮下注射 Iso 10.0 mg/kg，第三日予5.0 mg/kg，第四日予3.0 mg/kg，連續(xù)1 w，共10 d。自由進食，給水。各給藥組第二日開始灌胃(ig)給藥，每日一次，連續(xù)14 d，造模和給藥間隔時間4 h以上。對照組皮下注射等量生理鹽水，模型組和對照組等容積蒸餾水灌胃，末次給藥后禁食24 h，第15天處死動物。

1.2.3 MTT比色法檢測心肌成纖維細胞的增殖活力 各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組8復孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入5 g/L MTT 10 μl，待形成藍紫色的結(jié)晶沉淀后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl使沉淀降解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處檢測光吸收值(A值)，用只加培養(yǎng)液不加細胞的空白孔調(diào)零。

1.2.4 Hyp測定 分組同MTT法，換用24孔培養(yǎng)板，藥物作用48 h。操作步驟嚴格按試劑盒說明;取心尖心肌組織100 mg，生理鹽水洗凈后剪碎，加水解液1 ml混勻，放入帶蓋的玻璃磨口試管中，加蓋后，95℃或沸水浴水解20 min，按照說明依次加入試劑，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml檢測，按照說明書測定Hyp含量，所得值/0.134即為心肌中膠原蛋白的含量。

1.2.5 心肌組織形態(tài)學觀察 取左室近心尖1/2處心肌下部組織，分別行蘇木素-伊紅(HE)染色，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.2.6 心室重量指數(shù)測定 大鼠稱重處死，取出心臟，剔除心房、大血管、心外膜脂肪組織及瓣膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干，電子天平稱取心臟重量(HW)、心室重量(VW)、左室重量(LVW)，用心室重量除以大鼠體重計算出心室/體重指數(shù)，以心重(mg)/體重(g)表示。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS統(tǒng)計軟件，所有實驗結(jié)果以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下CFb生長形態(tài)的改變 各處理組作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。對照組細胞胞體較大，胞漿豐富，呈梭形;AngⅡ組增生活躍，呈編織狀生長，細胞生長密集;加入Ena后，細胞間隙逐漸增大，細胞體積縮小，透光度降低。見圖1。

2.2 MTT法檢測CFb的增值活力 AngⅡ組OD值(0.344 9±0.020 3)明顯升高，與對照組(0.254 3±0.065 3)相比有顯著性差異(P＜0.01)，可證實AngⅡ?qū)Fb有促增殖作用。加入不同濃度的 Ena后，OD值顯著低于 AngⅡ組(Ena 10-7、10-6、10-5mol/L 組 OD 值分別為 0.329 0 ± 0.030 4，0.287 3±0.025 0，0.220 6±0.056 0)，且呈劑量依賴性，與AngⅡ組相比有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。部分為局灶性或廣泛片狀分布，嚴重者壞死灶相連，累及心室壁全層，壞死處由心肌成纖維細胞取代。Ena干預組心肌損傷較AngⅡ組明顯減輕，呈片狀，主要位于心內(nèi)膜下。見圖2。

2.5 Ena對心室重量指數(shù)的影響 AngⅡ組HW/BW，低黏度指數(shù)(LVI)明顯升高，與對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，Ena三個劑量組均能降低 HW/BW、LVI水平，與Iso組比較，均不同程度地降低了HW/BW、LVI水平(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 Ena對心室重量指數(shù)的影響

2.3 Hyp法檢測CFb膠原蛋白含量 AngⅡ組 Hyp含量(2.37±0.18)與對照組(1.75±0.26)相比差異顯著(P＜0.05);用藥后，Hyp含量下降，隨Ena濃度增加有明顯的量效關系，與 AngⅡ組比較，Ena 10-7mol/L、10-6mol/L組(1.42±0.21，1.36±0.17)差異顯著(P ＜0.05)，Ena 10-5mol/L組(1.21±0.16)差異非常顯著(P＜0.01)。見圖2。

圖1 各組CFb生長形態(tài)變化(×100)

圖2 各組大鼠MF病理改變(×400)

2.4 Ena對Iso誘導大鼠MF病理學改變的影響 光鏡下HE染色可見對照組心肌肌纖維排列整齊，染色均勻一致;AngⅡ組心肌纖維斷裂缺損，排列紊亂，壞死灶主要位于心肌內(nèi)膜下，大

3 討論

心臟由心肌細胞和間質(zhì)細胞組成，間質(zhì)90%以上是CFb。MF在心肌細胞肥大的同時，伴有間質(zhì)CFb增殖及膠原分泌增加，其結(jié)果將引發(fā)心功能不全〔2〕。因此，CFb在MF發(fā)生過程中起著十分重要的作用。深入研究間質(zhì)重構(gòu)和CFb增殖的關系，采取有效措施預防和逆轉(zhuǎn)MF，控制心臟重構(gòu)，是基礎及臨床研究的熱點。

MF表現(xiàn)為心肌成纖維細胞增殖及其分泌的膠原增多，同時伴有心肌膠原成分的不成比例增加。MF引起的心室重構(gòu)包括實質(zhì)重構(gòu)和間質(zhì)重構(gòu)，前者表現(xiàn)為心肌細胞病理性肥大、變性、壞死等，后者主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)纖維化及細胞外基質(zhì)膠原網(wǎng)的含量變化和組成改變〔2〕。

現(xiàn)今塑造MF模型的方法很多，離體實驗多采用AngⅡ，在體實驗國內(nèi)外較為常用的方法為皮下注射大劑量Iso，其機制主要是增加了循環(huán)系統(tǒng)和心肌局部的AngⅡ濃度，從而導致MF的發(fā)生〔3〕，該模型具有MF改變出現(xiàn)早、效果穩(wěn)定持久、簡單易行、費用低廉等特點，成為研究MF的常用實驗方法。Iso作為β受體激動劑，可以增加心肌收縮力和收縮頻率，本身還可促進環(huán)磷酸腺苷生成和糖原合成增加，從而促進心肌細胞總蛋白和非收縮蛋白質(zhì)合成，致使心肌細胞肥大，膠原纖維增生。連續(xù)用β受體激動劑Iso刺激大鼠能引起大鼠心肌肥厚和MF〔4〕，其機制為激活 β-腎上腺素能受體(β-AR)、腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，并可能通過多種細胞信號轉(zhuǎn)導途徑影響纖維化過程。研究發(fā)現(xiàn)，Iso能夠通過整體激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、核轉(zhuǎn)移因子(NF)-κB、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活(JAK/STAT)等多種信號途徑引起肥厚性MF，但其詳細機制尚未明了。

Hyp是機體膠原蛋白的主要成分之一，在正常膠原蛋白中含量約13.4%，在彈性蛋白中含量極少，而在其他蛋白則不存在。因此，組織中Hyp含量可作為衡量其膠原組織代謝和判斷纖維化程度的重要指標。HW/BW、LVI指數(shù)目前已被許多實驗用來作為觀察心室纖維化的重要指標〔5〕，實驗中大鼠心室膠原蛋白濃度明顯增加。本實驗結(jié)果顯示，連續(xù)給大鼠背部皮下注射Iso，其HW/BW和LVI值明顯升高，提示使用Iso后大鼠心肌間質(zhì)纖維化明顯。而用Ena治療后，各劑量組大鼠的HW/BW、LVI顯著降低，提示Ena能減輕心肌肥厚，抑制心肌間質(zhì)細胞膠原含量增加而改善心肌重構(gòu)，與文獻報道一致〔6〕。

AngⅡ/Iso可以通過激活RAAS引起MF，導致心肌肥大、變性、壞死、CFb增殖伴隨ECM中大量膠原纖維堆積、MF，HW/BW、LVI、Hyp增多，Ena通過抑制 AngⅡ生成，保護緩激肽(BK)活性，降低上述各指標，從而逆轉(zhuǎn)或減少MF發(fā)生，但其詳細機制有待于在細胞水平上進一步研究

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