張 慶 彭明勇 馬 敏 (寧夏回族自治區(qū)第三人民醫(yī)院口腔科，寧夏 銀川 7500)

牙周炎是一種由多因素引起的感染性疾病，牙周細菌和機體防御機能的相互作用決定疾病的過程和進展〔1〕。維生素D受體(VDR)在維持機體鈣、磷代謝，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等方面起著重要的作用。關(guān)于VDR基因多態(tài)性的研究，目前發(fā)現(xiàn)與個體生長發(fā)育及人類疾病相關(guān)的基因多態(tài)性分別對應(yīng)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ的酶切位點。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，探討VDR基因TaqⅠ位點單核苷酸多態(tài)性與寧夏回漢人群中重度CP的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集病例組178例患者2007年10月至2009年10月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科的患者和健康對照者187例(健康志愿者)。以上研究對象均為寧夏本地人群，并且均知情同意參加本實驗，簽署知情同意書。病例組納入標(biāo)準(zhǔn):3代均為漢族或回族，未與其他民族通婚;口內(nèi)至少有14顆牙存在其中包括4顆磨牙(不含第三磨牙);無明顯的錯牙合畸形及不良修復(fù)體等;無糖尿病、心血管病等系統(tǒng)性疾病;不吸煙或戒煙5年以上;全口至少3個象限內(nèi)，每1象限內(nèi)至少有兩顆牙齒的探診深度(PD) ＞4 mm、附著喪失(CAL)≥3 mm;X線顯示牙槽骨吸收≥根長的1/3。對照組納入標(biāo)準(zhǔn):3代均為漢族或回族，未與其他民族通婚，牙周健康，全身健康無系統(tǒng)性疾病。由同一名醫(yī)師對所有受檢者進行全口牙周檢查，記錄口腔中所有余留牙的6個位點的牙周袋深度(probing depth，PD)及臨床附著喪失(clinic attachment loss，CAL)，參照ARMITAGE等〔2〕推薦標(biāo)準(zhǔn):健康對照組:平均CAL≤0.5 mm，無鄰面位點CAL≥3 mm;缺失牙≤2顆(第三磨牙、正畸拔牙、外傷性失牙、大面積齲壞失牙及先天性缺失牙除外)。對病例組和對照組的年齡和性別分布進行χ2檢驗，各組一般資料比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

1.2 主要試劑 血液基因組 DNA提取試劑盒、2×Taq PCRMasterMix、DNA markerⅠ(北京 TIANGEN 公司)、引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成(F:5'-GGAGAAGTCACTG-GAGGGC-3'，R:5'-GGATCATCTTGGCATAGAGC-3'〔3〕)、Taq Ⅰ限制性內(nèi)切酶(MBI公司提供)、PCR儀、電泳儀、全自動凝膠圖像分析儀，電熱恒溫水浴箱、臺式離心機。

表1 各組年齡性別比較(n)

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取外周靜脈血5 ml，采集管中加入EDTA抗凝，4℃保存。采用上述DNA提取試劑盒提取外周血總基因組DNA，－20℃保存。

1.3.2 PCR 擴 增 模 板 DNA 2 μl，dNTP 2.5 μl(2.5 mmol/L)，10 × 緩沖液 2.5 μl(含 Mg2+)，引物 S、A 各1.0 μl(15 pmol/L)，TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，用無菌去離子水補足總體積至25 μl。反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 5 min;94℃30 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35 個循環(huán)，最后 72℃延伸 5 min。擴增片段長度為307 bp。

1.3.3 TaqⅠ酶切 酶切總體系20 μl，其中PCR擴增產(chǎn)物8 μl，相應(yīng)緩沖液 1.5 μl，TaqⅠ內(nèi)切酶 1 U，加無菌去離子水補足總體積，于37℃水浴消化過夜。不含TaqⅠ(T^CGA)酶切位點，只出現(xiàn)307 bp一個片段;含有該酶切位點，被切成2個片段(209 bp、98 bp)。

1.3.4 多態(tài)性分析 取酶切產(chǎn)物10 μl，用2.5%的瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并分析基因型。分型標(biāo)準(zhǔn):CC基因型為307 bp 1個片段，CT基因型為307、209、98 bp 3 個片段，TT 基因型為209 bp、98 bp 2 個片段。

1.3.5 PCR質(zhì)量控制措施 所有實驗標(biāo)本的測定均在盲法下進行，并隨機抽取10%樣本作重復(fù)性實驗，檢測PCR結(jié)果的可靠性。隨機選擇10%的標(biāo)本進行PCR擴增后直接測序，以驗證酶切所得的基因型數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 (1)Hard-Weinberg Equilibrium分析(H-W平衡):本研究應(yīng)用H-W平衡軟件計算基因型的分布，P＞0.05，則說明研究人群符合 H-W 平衡。(2)病例-對照分析(Case-Control Test):用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用 χ2檢驗，對病例組和對照組的一般資料(年齡、性別)及兩組基因型和等位基因頻率的分布進行比較。

2 結(jié)果

樣品提取、PCR擴增和酶切均獲成功，基因型測定的典型電泳結(jié)果見圖1，測序圖見圖2。回、漢族兩組VDR基因TaqⅠ位點基因型和等位基因頻率的分布見組間有顯著差異(均P＜0.05)，但兩民族的CP組基因型和等位基因頻率分布無差異(χ2=0.074，P=0.785;χ2=0.072，P=0.788)，表2、表3。

圖1 VDR基因rs731236位點限制性片段長度多態(tài)性

圖2 VDR基因TaqⅠ(rs731236)位點測序結(jié)果

表2 回族TaqⅠ(rs731236)位點基因型及等位基因頻率的分布〔n(%)〕

表3 漢族TaqⅠ(rs731236)位點基因型及等位基因頻率的分布〔n(%)〕

3 討論

牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織上的慢性感染性疾病，是造成老年人失牙的最主要的原因〔3〕。其發(fā)病率因國家、地區(qū)和種族的不同而有所差別〔4〕并且早期臨床表現(xiàn)不明顯，就診時牙周組織往往已經(jīng)發(fā)生了不可逆的變化，進而嚴(yán)重影響牙合系統(tǒng)的完整性和咀嚼功能，同時牙周炎會成為病灶影響全身的健康及加重一些全身疾病的進展。隨著我國進入老齡化社會，牙周病將成為突出的健康問題。

Michalowicz等〔5〕采用遺傳學(xué)經(jīng)典雙生子法揭示遺傳因素與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展存在重要關(guān)系和近些年流行病學(xué)深入研究的雙重影響下，越來越多的證據(jù)表明不同宿主對牙周炎的易感性有很大差異，某些基因的遺傳多態(tài)性影響著牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。文獻報道與牙周炎易感性有關(guān)的基因有:白細胞介素-1基因(IL-1)、VDR基因、腫瘤壞死因子α基因(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等。牙周炎的主要癥狀之一就是牙槽骨的吸收，牙槽骨是全身骨骼系統(tǒng)的一部分，也是全身骨骼系統(tǒng)中變化最為顯著的部分，其變化與牙齒的發(fā)育、萌出及乳、恒牙的替換、咀嚼功能的發(fā)揮和牙齒的移動等有關(guān)系。該變化反映出骨組織的改建過程，即破骨和成骨兩者相互平衡的生理過程〔6〕。VDR基因直接與骨密度代謝有關(guān)，成為研究CP的一個熱點基因。

在我們的研究結(jié)果中:漢族和回族CP組及對照組均未出現(xiàn)TT基因型，這可能與TT基因型在中國漢族人群中的攜帶率低等因素有關(guān)，還可能與樣本量較少有關(guān)。我國漢族人群TT基因型頻率為0.6%，與韓國人的分布頻率相似〔7〕，而遠低于白種人的分布頻率(TT基因型頻率均為10% ～17%)〔6〕。關(guān)于TaqⅠ位點與CP的研究，國內(nèi)外學(xué)者在不同地區(qū)對不同種族的人群進行了大量研究，結(jié)論有較大分歧。Nibali等〔8〕對英國79名CP和231名健康對照者進行了研究;de Brito等〔9〕、Borges等〔10〕在巴西人群中分別進行了研究;Tachi等〔11〕、Kobayashi等〔12〕在日本人群中分別進行了該位點的研究;國內(nèi)王春先等〔13〕也進行了該點的研究，他們的研究結(jié)果提示TaqⅠ SNP位點可能與CP的易感性有關(guān)。本研究結(jié)果同以上學(xué)者的研究結(jié)果一致，但與 Gunes等〔14〕、Sun 等〔15〕、還有章錦才等〔16〕的研究結(jié)果不同。對于研究結(jié)果的不一致可能與不同地區(qū)、不同種族的遺傳特征不同有關(guān)，還可能與樣本量大小有關(guān)〔17〕。

關(guān)于TaqⅠ位點多態(tài)性的作用機制問題，有學(xué)者認為:在基因的翻譯、表達過程中，蛋白質(zhì)的合成受mRNA 3'末端非翻譯區(qū)的調(diào)控，該區(qū)域的內(nèi)在特性影響著mRNA的穩(wěn)定性，它對RNA酶特別敏感，VDR基因TaqⅠ的酶切位點正位于該區(qū)域，如果該區(qū)域的堿基有任何改變，都會影響VDR基因的調(diào)控而影響VDR的表達，如改變受體的數(shù)量，影響增強子對靶位的親和力或影響與維生素D的親和力〔18〕。

慢性牙周炎是多因素引起的炎癥性疾病，微生物是其發(fā)生的始動因子，某些全身性疾病、遺傳、環(huán)境和行為因素等也可能是其發(fā)病的危險因素。VDR基因直接與骨代謝有關(guān)，不同地區(qū)、不同民族的遺傳學(xué)特征可能存在明顯差異。所以對于VDR基因多態(tài)性與CP之間的關(guān)系還需要在不同地區(qū)、不同民族之間進行更大樣本的研究，并進行以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究，還要與其他可能的易感基因進行連鎖分析。

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