齊 詠 馬利軍 牛紅麗 程劍劍 吳紀珍 (河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性炎癥過程，不僅影響肺，也可以引起顯著的全身反應，包括體重下降、營養(yǎng)不良、骨骼肌功能障礙等。研究發(fā)現(xiàn)50%的重度以及10%～20%的輕、中度COPD患者存在無法解釋的體重下降，部分極度消瘦，嚴重者甚至發(fā)生“肺惡病質(zhì)綜合征”，但其確切機制尚未闡明。本研究以穩(wěn)定期COPD患者為觀察對象，觀察不同營養(yǎng)狀況COPD患者外周血單核細胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和炎癥因子表達情況，探討COPD體重下降與系統(tǒng)炎癥的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 30例COPD患者為我院2007年12月至2009年12月門診及住院患者，均符合我國2002年制定的《慢性阻塞性肺疾病(COPD)診治指南》中COPD的診斷標準，臨床屬于穩(wěn)定期，體重指數(shù)(BMI)＜18.5 kg/m2〔1〕。正常對照組30例，均來自門診健康體檢者。兩組患者在性別、年齡方面差異無顯著性，具有可比性。

1.2 方法 入選對象均進行詳細的病史詢問及體格檢查。

1.3 血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素-8(IL-8)濃度的檢測分離血清后采用ELISA法測定TNF-α、IL-8的含量。試劑為美國RB公司產(chǎn)品，操作按照說明書進行。

1.4 外周血NF-κB檢測

1.4.1 密度梯度離心法分離單個核細胞 受試者均于上午8～9時空腹取肘靜脈血6 ml，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法常規(guī)分離外周血單個核細胞(PBMCs)，將細胞調(diào)至1 ×106/ml。

1.4.2 提取核蛋白 分離出淡黃色層單核細胞，移入另一離心管，加入10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心3 000 r/min，5 min;吸除上清液，將洗過的細胞移至1.5 ml Ependorff管，再懸浮于1 ml PBS，在高速離心機中離心10 000 r/min×30 s;仔細吸除上清液，加入0.4 ml緩沖液A，放在冰上膨脹15 min;加入25 μl 10%壬基酸聚氧乙烯醚(NP-40)，強渦處理10 s，離心12 000 r/min ×30 s;吸除上清液，加緩沖液 B 200 μl，4℃ 強烈振蕩15 min;4℃離心10 000 r/min×5 min，上清液即為核蛋白，每份樣品分裝5個1 ml EP管中，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 NF-κB活性水平檢測 NF-κB試劑盒購于美國RB公司，按試劑盒說明書操作。用 ELISA法檢測 NF-κB在波長595 nm處的吸光度值(OD值)。根據(jù)標準品繪制濃度曲線，再根據(jù)OD值在標準曲線上查出NF-κB活性水平。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS14.0軟件包處理，數(shù)據(jù)采用±s表示，所用統(tǒng)計分析方法為成組t檢驗及直線相關分析。

2 結果

2.1 NF-κB含量在各組之間的變化 COPD組經(jīng)LPS刺激后NF-κB活性水平為(720.41±265.62)pg/ml，高于未經(jīng) LPS刺激組〔(457.14±227.95)pg/ml，P ＞0.05〕，但無統(tǒng)計學意義。對照組經(jīng) LPS刺激后 NF-κB活性水平為(252.82±74.23)pg/ml，高于未經(jīng) LPS 刺激組〔(87.22 ± 33.41)pg/ml，P ＜0.05〕。

2.2 TNF-α、IL-8在COPD組和對照組血清中的濃度變化COPD組血清TNF-α、IL-8的濃度均較對照組顯著增高(P＜0.05)。見表1。

表1 不同組血清TNF-α、IL-8濃度比較(±s，pg/ml)

表1 不同組血清TNF-α、IL-8濃度比較(±s，pg/ml)

IL-8 COPD組組別 n TNF-α 30 60.41±13.04 45.23±4.03正常組 30 23.20±5.83 18.82±5.14 P值 ＜0.000 15 ＜0.000 15

2.3 COPD組NF-κB的表達與血清 TNF-α、IL-8濃度的相關性 COPD組NF-κB與IL-8之間存在明顯正相關(r=0.763，P ＜0.001)，與 TNF-α 也存在正相關(r=0.407，P ＜0.05)。

2.4 COPD組炎性介質(zhì)與BMI的相關關系 TNF-α與BMI呈顯著負相關(r=-0.433，P ＜0.05)。IL-8、NF-κB 與 BMI存在負相關趨勢，但無統(tǒng)計學意義(r=-0.074，-0.314，均P＞0.05)。

2.5 COPD組與對照組BMI比較 BMI水平在COPD組為(16.21±2.04)kg/m2，對照組為(24.59 ±3.11)kg/m2，組間比較差異顯著(P=0.000 67)。

3 討論

COPD不僅表現(xiàn)為肺部的局部炎癥，也表現(xiàn)為一種輕度的全身炎癥反應〔2〕。目前對這種全身炎癥反應尚無公認的定義，但大多數(shù)文獻把其定義為炎癥級聯(lián)反應中部分炎癥細胞和/或炎癥介質(zhì)等在血液循環(huán)中的增高，包括中性粒細胞及巨噬細胞增多、淋巴細胞中細胞色素氧化酶活性增高、單核細胞MMP-9增高以及IL-6、IL-8、TNF-α、CRP等增高。大多數(shù)炎癥細胞和炎癥介質(zhì)通過復雜的網(wǎng)絡發(fā)揮作用，細胞與介質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞可以引起系統(tǒng)的慢性炎癥病理改變。Fabbri等〔2〕認為應稱其為慢性全身炎癥反應綜合征，可能更能說明COPD全身炎癥的危害。本實驗顯示，低體重COPD患者穩(wěn)定期血清TNF-α、IL-8的濃度較正常對照組顯著增高。說明低體重COPD患者在穩(wěn)定期存在全身炎癥反應。

NF-κB是Sen等于1986年首次從小鼠B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結合的蛋白因子，激活NF-κB已成為肺部炎癥性疾病的一個重要特征。本實驗結果顯示，COPD組經(jīng)LPS刺激的血樣NF-κB含量高于未經(jīng)LPS刺激的正常組，提示COPD患者在穩(wěn)定期存在全身炎癥反應，體內(nèi)炎性因子含量較正常對照組高，與以往的研究結果一致〔3〕。本實驗發(fā)現(xiàn) NF-κB與TNF-α、IL-8的含量呈顯著正相關。NF-κB介導多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，而TNF-α、IL-8則又成為 NF-κB的激活劑，從而形成了 NF-κB與炎癥因子間的正反饋效應。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可以誘導急性期反應蛋白如C3、C4、血清淀粉酶、誘導型NO合成酶(iNOS)、環(huán)氧合酶(COX-2)等炎性酶的產(chǎn)生，說明NF-κB除誘導炎性基因的表達外，還導致凝血-纖溶、激肽、補體和花生四烯酸等四大系統(tǒng)的相互激活，產(chǎn)生過度炎癥反應。它們互相促進，加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展，使肺臟反復損傷與修復、引起肺臟纖維化的發(fā)生，最終導致氣道結構的重塑和氣流阻塞，嚴重影響肺臟功能。

營養(yǎng)不良已被認為是COPD患者預后不良的獨立、可逆的一個標志。BMI是營養(yǎng)參數(shù)中一個重要指標，本實驗對低體重COPD患者NF-κB含量、血清炎癥因子含量與BMI進行直線相關分析。發(fā)現(xiàn)COPD患者血清TNF-α含量與BMI呈顯著負相關(r=-0.433)。體外實驗證明注射重組IL-6、IL-1、TNF-α可導致健康動物厭食、體重減輕和惡病質(zhì)。Avram等發(fā)現(xiàn)一種高效蛋白降解途徑即泛素-蛋白酶體途徑，這個途徑主要作用是對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進行降解，而這種降解活動依靠NF-κB來轉(zhuǎn)換，有活性的核因子進入細胞核并和DNA上的啟動區(qū)域結合，調(diào)整泛素蛋白酶體，最后交互作用減少肌肉蛋白的合成。

綜上所述，穩(wěn)定期低體重COPD患者存在全身炎癥反應，NF-κB介導多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，炎性因子表達可能與COPD患者體質(zhì)量下降有關。

1 中國肥胖問題工作組數(shù)據(jù)匯總分析協(xié)作組.我國成人體重指數(shù)和腰圍對相關疾病危險因素異常的預測價值:適宜體重指數(shù)和腰圍切點的研究〔J〕.中華流行病學雜志，2002;23(1):5-10.

2 Fabbri LM，Rabe KF.From COPD to chronic systemic inflammatory syndrome〔J〕.Lancet，2007，370(9589):797-9.

3 齊 詠，楊 嵐，于維霞，等.氧化抗氧化失衡對慢性阻塞性肺疾病患者誘導痰巨噬細胞NF-κB活性的影響〔J〕.中國老年學雜志，2004;24(12):1142-4.