毛孫忠,鄧 蔚,2,許芳芳,薛 峰,2,胡良岡,2,申屠楊萍,2,范小芳,2,龔永生,2△
(溫州醫(yī)學院1低氧醫(yī)學研究所,肺心病研究室,2機能實驗教學中心,機能實驗學教研室,浙江 溫州 325035)
尾加壓素II(urotensin II,UⅡ)是迄今所知最強的縮血管活性肽[1],UⅡ及其受體——G蛋白偶聯(lián)受體14(G-protein-coupled receptor 14,GPR14)分布廣泛,在腦、腎、心及肺等均有表達。新近研究發(fā)現(xiàn):UⅡ作為一種具有絲裂原作用的自分泌/旁分泌因子,參與了糖尿病性腎纖維化的進程[2];低氧可使機體UⅡ分泌增加[3],而低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,UⅡ與低氧性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),運動通過降低循環(huán)UⅡ的含量對自發(fā)性高血壓具有降壓作用[4],運動可否通過調(diào)節(jié)UⅡ/GPR14對低氧性腎間質(zhì)纖維化具有干預作用目前仍未明了。本研究旨在通過觀察慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化大鼠UⅡ/GPR14的變化及游泳運動在其中的作用,以期為慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制及防治提供新的思路。
清潔級雄性SD大鼠45只,體重300~350 g,由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)3 d后,隨機均分成對照組、低氧組和游泳組。按以往的方法制備大鼠低氧模型[5],低氧組與游泳組置于自制常壓低氧艙內(nèi),艙內(nèi)吸入O2濃度9% ~11%,CO2濃度<3%,每天8 h,連續(xù)7周。游泳組在低氧3周后,于每天進艙2 h前進行無負重游泳運動,每次1 h,每天1次,共4周。游泳池為自制的圓形不銹鋼桶,內(nèi)徑50 cm,水溫為(33±2)℃,水深65 cm。對照組置于艙外,自由呼吸空氣,其它飼養(yǎng)條件相同。
動物飼養(yǎng)到規(guī)定時間后,用戊巴比妥鈉(35 mg/kg,ip)麻醉,行左頸總動脈插管取血,分別置入含肝素及預冷含10%EDTANa2、抑肽酶抗凝的試管中,4000 r/min 4℃離心10 min,取上清液-70℃保存待測。放血處死動物后,取左腎組織約100 mg,待測組織羥脯氨酸的含量;取右腎組織約100 mg提取總RNA,待測UⅡ mRNA和GPR14 mRNA水平。
每組隨機各取3只大鼠麻醉后,經(jīng)左心室行主動脈插管,用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各約500 mL先后灌注固定。開腹,取右上半腎組織(橫切)置于4%多聚甲醛中進一步固定24 h。按石蠟或冰凍切片技術(shù)要求取材、包埋、切片。
化學比色法檢測血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)的含量;制備10%腎組織勻漿,化學比色法檢測腎組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,以考馬斯亮藍法測定蛋白含量,以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。ELISA法測定血漿UⅡ含量,試劑盒由Phoenix Pharm aceuticals Inc.提供。嚴格按說明書操作。
腎組織石蠟包埋切片,切片厚度約5 μm,苦味酸-酸性品紅(van Gieson,VG)染色觀察腎間質(zhì)纖維化情況(膠原纖維為鮮紅色)。試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。
采用RT-PCR法檢測腎組織 UⅡ mRNA和GPR14 mRNA的表達水平。Trizol一步法制備大鼠腎組織總RNA。常規(guī)PCR法擴增產(chǎn)物,UⅡPCR引物的上、下游序列分別為5'-GAG CAG ACA CCC AGC CAG ACT T-3'和5'-TGC CCA GTG AGA GCC TTC CT-3'(PCR產(chǎn)物為306 bp,退火溫度為60℃);GPR14為5'-GCC TGG CTT GGT CAT TGG G-3'和5'-GCA GAG TGT AGA GGA AGG GAT TGA TG-3'(PCR產(chǎn)物為293 bp,退火溫度為68℃);β-actin為5'-CTG AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC -3'和5'- GTG CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC-3'(PCR產(chǎn)物為357 bp,退火溫度為68℃),引物均由賽百盛基因有限公司合成。擴增產(chǎn)物行1.25%瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)凝膠成像儀(Gene Genius)分析結(jié)果,分別計算UⅡ和GPR14 mRNA/β-actin條帶吸光度的比值作為其mRNA的相對含量。重復3次實驗。
選擇右腎上半中部,應用恒冷冰凍切片機橫位連續(xù)切片,厚約10 μm。免疫組織染色采用SP法,Ⅰ抗?jié)舛葹? mg/L,4℃過夜,DAB顯色,蘇木素復染,陽性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。用PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。每個標本取3張切片,每張切片隨機選取10個非重復視野,光鏡下觀察腎小球單位及其腎小管染色情況,進行定位研究。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測其平均吸光度值(absorbance,A)及累積吸光度值(IA)作為UⅡ蛋白表達的相對含量。
低氧組Scr和BUN含量較對照組分別低18.5%和14.1%(均P<0.05),而游泳組與低氧組間無顯著差別。低氧組腎組織Hyp含量比對照組高42.9%(P<0.01),而游泳組較低氧組低26.1%(均P<0.05)。低氧組血漿UⅡ含量較對照組高380.8%(P<0.01),而游泳組較低氧低42.6%(P<0.01),見表1。
表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN,Scr,plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)
表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN,Scr,plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)
*P <0.05,**P<0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.
Group Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)Hyp(mg/g)UⅡ(μg/L)Control 57.2 ±11.0 10.55 ±1.60 0.408±0.045 2.13±0.67 Hypoxia 46.6 ±10.7* 9.06 ±1.47* 0.583±0.200** 10.24 ±1.27**Swimming 42.7 ±7.0 8.75 ±0.71 0.431±0.039## 5.88 ±0.91##
低氧組腎組織UⅡ mRNA表達較對照組上調(diào)104.5%,而游泳組較低氧組下調(diào)33.2%(均 P<0.01);低氧組腎組織GPR14 mRNA較對照組上調(diào)35.4%(P<0.01),而游泳組與低氧組間無顯著差別(P >0.05),見表2、圖1。
表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)
表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)
**P <0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.
0.881 ±0.145 Control 0.337 ±0.041 0.593 ±0.022 Hypoxia 0.689 ± 0.035** 0.803 ± 0.073**Swimming 0.460 ±0.034##
Figure 1.Results of RT-PCR for UⅡmRNA and GPR14 mRNA in renal tissues of rats.1:marker;2 ~ 4:control group;5~7:hypoxia group;8~10:swimming group.圖1 各組腎組織RT-PCR電泳結(jié)果
免疫組化結(jié)果分析顯示低氧組腎組織UⅡ蛋白的A及IA值表達均較對照組明顯上調(diào)(P<0.01),而游泳組較低氧組明顯下調(diào)(P<0.01)。光鏡下觀察顯示:對照組大鼠腎組織棕黃色顆粒主要見于腎皮質(zhì)的腎小管上表達,腎小球內(nèi)未見明顯表達;低氧組腎組織棕黃色顆粒表達明顯強于對照組,腎皮質(zhì)的腎小管上表達強陽性,腎小囊囊壁和腎血管內(nèi)皮細胞層可見少量表達;游泳組棕黃色顆粒表達明顯低于低氧組,腎皮質(zhì)的腎小管上表達較強。陰性對照細胞胞核及胞膜呈藍色,胞漿及整片組織呈淡藍色,見表 3、圖2。
表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)
表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)
**P <0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.
Group A IA Control 0.205 ±0.045 2353 ±541 Hypoxia 0.461 ± 0.030** 5232 ±493**Swimming 0.299 ±0.031## 3422 ±525##
光鏡觀察結(jié)果顯示,對照組腎血管及周圍見少量鮮紅色染色,低氧組腎血管及周圍見較多鮮紅色染色,即間質(zhì)細胞增生、膠原纖維明顯增多,游泳組腎血管及周圍鮮紅色染色面積較少,見圖3。
Figure 3.Histopathological changes in renal tissues of rats(VG staining,×400).A:control group;B:hypoxia group;C:swimming group.圖3 各組腎組織病理學檢查
慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一組進行性發(fā)展的慢性疾病,具有很高的死亡率和致殘率。腎間質(zhì)纖維化是CKD進展到終末期時的共同病變過程,延緩或防止腎纖維化是防治CKD進展的關(guān)鍵。低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)病重要的致病因素之一。有關(guān)低氧引起腎臟纖維化的機制目前尚不清楚,氧化應激、血管活性物質(zhì)失衡、炎癥反應、增殖與凋亡等多因子、多因素都與該病理生理進程有關(guān)[6]。目前認為促纖維化細胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β,TGF - β)、內(nèi)皮素1等,在其中起著非常重要的作用[7]。
UⅡ是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強的多肽(較之前被認為收縮血管活性最強的內(nèi)皮素-1還強6-28倍)。UⅡ及其受體GPR14在體內(nèi)分布廣泛,在心血管、腎臟、肺、神經(jīng)和內(nèi)分泌組織均有表達[8]。UⅡ可通過內(nèi)分泌、旁/自分泌的方式發(fā)揮多種生物學效應,對心腦血管穩(wěn)態(tài)、水鹽平衡及炎癥免疫等具有重要的調(diào)節(jié)作用,參與了高血壓、動脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的進程[9]。新近研究發(fā)現(xiàn),UⅡ作為一種有絲裂原作用的自分泌/旁分泌的生長因子,具有促細胞增殖和促細胞外基質(zhì)表達等效應[10],UⅡ是否參與低氧性腎間質(zhì)纖維化的進程目前尚不清楚。羥脯氨酸是反映組織膠原含量的指標,膠原堆積是腎纖維化的表現(xiàn)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):慢性低氧大鼠腎臟組織羥脯氨酸含量較正常對照組顯著增高,VG染色顯示膠原纖維染色的強度和面積均明顯升高,同時血漿UⅡ含量顯著升高,腎組織UⅡ mRNA和蛋白的表達均顯著上調(diào),GPR14 mRNA的表達亦顯著性上調(diào),提示UⅡ/GPR14參與了慢性低氧致腎臟纖維化的進程。Zhang等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)UⅡ與TGF-β介導的糖尿病性腎纖維化密切相關(guān)。
目前臨床上根據(jù)腎臟纖維化發(fā)病機制采取藥物干預方法,對延緩CKD的進展、改善CKD預后取得了一定的療效,但仍有25%左右的CKD患者腎臟病變進行性發(fā)展,因此改進當前單純藥物干預的治療方略尤顯重要。運動對腎臟功能的影響歷來為運動醫(yī)學所重視。有研究表明,運動對自發(fā)性高血壓具有降壓作用與其降低循環(huán)UⅡ含量有關(guān)[3],運動對低氧性腎間質(zhì)纖維化是否具有干預作用、該干預作用是否與UⅡ/GPR14有關(guān)目前尚未明了。研究表明,適度的有氧運功可改善腎功能,而劇烈運動可引起腎損傷,甚至出現(xiàn)急性腎衰竭[11]。關(guān)宇光等[12]發(fā)現(xiàn)長期有氧運動可以降低血漿UⅡ含量,每天1 h無負重游泳訓練可使大鼠血漿UⅡ含量下降,而1次3%負重力竭游泳運動后血漿UⅡ含量卻顯著升高,故本實驗大鼠每天游泳定為1 h無負重游泳運動。另外,Scr和BUN是反映腎功能的常用指標,急慢性腎功能衰竭時Scr和BUN均明顯增高。本實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)該強度下的游泳組大鼠BUN和Scr含量與其它組別無明顯差異。
本實驗發(fā)現(xiàn),游泳運動4周后,游泳組大鼠腎組織羥脯氨酸值較低氧組顯著降低,VG染色顯示膠原纖維染色強度及面積也明顯降低,提示長期適度游泳運動對慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用。實驗還發(fā)現(xiàn),游泳組大鼠血漿UⅡ含量較低氧組顯著降低,腎組織UⅡmRNA和蛋白表達亦顯著下調(diào),而GPR14 mRNA的表達2組間無顯著差異。有報道,運動可降低血漿UⅡ含量對自發(fā)性高血壓具有降壓作用[4],提示適度游泳運動對慢性低氧腎間質(zhì)纖維化的防治作用與降低循環(huán)UⅡ含量和改善腎組織UⅡ的表達有關(guān)。長期有氧運動后,循環(huán)中UⅡ含量的降低一方面可通過降低UⅡ?qū)ρ艿闹苯邮湛s作用和改善縮/舒血管活性物質(zhì)失衡[8],進而促進腎臟血供,緩解腎缺血缺氧癥狀;另一方面減弱UⅡ促增殖作用及對腎小管上皮細胞的促絲裂原作用,改善腎臟組織促纖維化細胞因子與抗纖維化細胞因子(如間質(zhì)金屬蛋白酶-2)間的失衡,緩解腎上皮細胞間質(zhì)化和腎間質(zhì)成纖維細胞活化的發(fā)生[7],進而延緩腎纖維化的進程。今后可以通過或配合與UⅡ生物學效應有關(guān)的拮抗劑來達到強化防治低氧性腎間質(zhì)纖維化的效果,有待進一步的研究。
本實驗結(jié)果提示:慢性低氧性腎纖維化大鼠UⅡ及其受體的表達上調(diào);適度游泳運動對慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用,并下調(diào)UⅡmRNA與蛋白的表達,推測該作用可能與調(diào)節(jié)UⅡ的表達有關(guān),但尚有待進一步研究證實。
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