張火旺

(廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000)

止痢寧片由穿心蓮、苦木、木香3味中藥組成，具有清熱祛濕、行氣止痛之功效，用于腸炎、痢疾等癥?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]中，只有定性方法，無含量測定方法。已有文獻報道對止痢寧片中的穿心蓮內(nèi)酯[2]、脫水穿心蓮內(nèi)酯[3]分別進行了質(zhì)量控制，但僅控制1種成分不能較全面地反映產(chǎn)品的質(zhì)量。為更好地控制該藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全、有效，筆者采用高效液相色譜法同時測定止痢寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，作為該產(chǎn)品質(zhì)量控制指標(biāo)之一，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型自動高效液相色譜儀，日本島津UV－2450型紫外分光光度計，CP225D型電子天平，SB2200型超聲處理器。甲醇(色譜純，TEDIA);水為超純水;穿心蓮內(nèi)酯對照品(批號為110797－200307)、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品(批號為 110854－200306，供含量測定用)均購自中國藥品生物制品檢定所，含量均為 100%;止痢寧片(市售品，批號分別為 101006，090601，090703，090901)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(50∶50);穿心蓮內(nèi)酯檢測波長∶225 nm;脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長∶250 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL。以峰面積外標(biāo)法定量[4]。

2.2 溶液制備

精密稱取10.25 mg經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的穿心蓮內(nèi)酯對照品，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液;精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的脫水對照品10.10 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為脫水穿心蓮對照品貯備液;兩種對照品貯備液均用0.45 μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(過三號篩)，精密稱取適量(約相當(dāng)于2片的質(zhì)量)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，密塞，置超聲儀超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例同法制備不含穿心蓮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗:分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按上述色譜條件進樣測繪高效液相色譜圖，結(jié)果兩組分的出峰時間區(qū)域沒有干擾峰，表明處方中其他成分和輔料對樣品的測定無干擾作用(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液各 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置50 mL和25 mL量瓶中，加甲醇至刻度并搖勻，分別配成穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣10 μL，測定峰面積。以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程穿心蓮內(nèi)酯為 A=25.555C+0.6413(r=1.0000)，脫水穿心蓮內(nèi)酯 A=20.234C－12.099(r=0.9998)。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的進樣量分別在0.0205～0.1230μg和0.0808～0.4848μg范圍內(nèi)與相應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD分別為1.7%和0.48%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品，精密稱取6份，按樣品測定方法平行測定兩組分的含量。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的RSD分別為0.73%和0.70%(n=6)，表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗:取同一批供試品溶液，在室溫放置，每隔2 h測定1次，連續(xù)測定7次。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的RSD分別為0.82%和0.53%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗:精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品10.20 mg，置50 mL量瓶中，精密吸取5 mL，置20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液(含穿心蓮內(nèi)酯0.0510 g/L);精密稱取已知含量的樣品(批號為101006，穿心蓮內(nèi)酯含量0.6250 mg/g，平均片重0.3500 g/片)適量，共6份，分別加入上述對照品溶液2，4，5 mL，按供試品溶液制備的方法操作，進樣測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。另取2.2項下的脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液(含脫水穿心蓮內(nèi)酯0.2020 g/L)，作為脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液;精密稱取已知含量的樣品(批號為101006，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量 1.1220 mg/g，平均片重 0.3500 g/片)適量，共 6 份，分別加入上述對照品溶液1，2，3 mL，按供試品溶液制備的方法操作，進樣測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，按擬訂的方法制備供試品溶液，進樣 10 μL，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。根據(jù) 4批樣品所測結(jié)果，暫定止痢寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯總量定量限為1.0 mg/g。

3 討論

在選擇檢測波長時，取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，用甲醇為溶劑，經(jīng)紫外－可見分光光度計掃描，穿心蓮內(nèi)酯在225 nm波長下有最大吸收，而脫水穿心蓮內(nèi)酯在250 nm波長有最大吸收，靈敏度高，故選225 nm作為穿心蓮內(nèi)酯檢測波長，250 nm作為脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長。

分別超聲處理樣品 10，20，30，40，60 min，測得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量最高的系超聲處理30 min，故認(rèn)為超聲處理30 min基本提取完全，最終選用甲醇超聲處理30 min。

曾以甲醇－水溶液(55∶45)為流動相，但樣品的分離度不好，主峰形不好;用甲醇－水溶液(40∶60)為流動相時，主峰分離好，但保留時間太長，不適合作研究;而用甲醇－水溶液(50∶50)為流動相時主峰形較對稱，分離效果較好。

表2 4批樣品含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

4批樣品中，不同廠家生產(chǎn)的批次含量相差較大，但部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)沒有含量測定標(biāo)準(zhǔn)。方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的方法回收率、精密度、重現(xiàn)性好，這樣就能更好、更進一步完善止痢寧的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。

本方法同時測定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，操作簡便、快捷，精密度和準(zhǔn)確度都較好。原標(biāo)準(zhǔn)無含量測定，本方法的建立，有利于更好地提高和控制藥品質(zhì)量。

[1]WS3－B－0703－91，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第 4 冊)[S].

[2]王先友，袁 琦.HPLC色譜法測定止痢寧片中穿心蓮內(nèi)酯含量[J].河南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009，28(1):11－12.

[3]單 敏，劉海靜，喬蓉霞.HPLC色譜法測定止痢寧片中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].陜西中醫(yī)，2004，25(6):553－554.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄29.