程 林 浦錦寶 鄭軍獻(xiàn) 梁衛(wèi)青 胡軼娟 魏克民

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索(corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛的功效，用于治療胸肋、脘腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌打腫痛等癥［1，2］。延胡索含多種生物堿，其中以延胡索甲、乙、丙素(原阿片堿)等為其主要成分［3］。延胡索為著名的浙八味之一，主產(chǎn)浙江省東陽(yáng)、磐安一帶，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)［4～11］對(duì)延胡索藥材的指紋圖譜進(jìn)行了研究。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:Varian高效液相色譜系統(tǒng)(Prostar 230，330，410)，BP 211D電子天平(德國(guó) Sartorius公司)，色譜純甲醇(Merck)，高純水，其余試劑為分析純。延胡索乙素購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)為110726－201011)。13批藥材作為供試品1～13號(hào)，其來(lái)源依次為:浙江磐安新渥鎮(zhèn)新渥村下塢、浙江磐安新渥鎮(zhèn)新渥村方崗嶺、浙江仙居田市、浙江磐安安文鎮(zhèn)胡村下百稱、浙江磐安深澤鄉(xiāng)上嶺頭、浙江磐安安文鎮(zhèn)王隱坑村、浙江磐安安文鎮(zhèn)胡村上門、浙江磐安安文鎮(zhèn)王隱坑村、陜西佛平縣、陜西漢中城固縣、陜西漢中城固縣、陜西漢中城固縣、浙江磐安深澤鄉(xiāng)上亨塘村。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:延胡索乙素對(duì)照品溶液0.300mg/ml，與4℃冰箱保存。(2)供試品溶液制備:取延胡索生品粉末約0.5g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入濃氨∶甲醇(1∶20)30ml，稱定重量，冷浸 1h 后，加熱回流 1h，放冷稱重，用濃氨∶甲醇(1∶20)補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μmol/L)過(guò)濾即得。(3)層析條件:層析柱:Thermo hypersil GOLD C18(250mm ×4.6mm，粒徑5.0μm);流動(dòng)相:A 相(甲醇)，B 相(0.1% 磷酸水pH5.0);梯度洗脫程序見(jiàn)表1。進(jìn)樣體積15μl，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。(4)方法學(xué)考察:①對(duì)照試驗(yàn):取延胡索乙素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5μl，記錄層析圖，結(jié)果見(jiàn)圖1;②精密度試驗(yàn):取同一供試品溶液(1號(hào)樣品)，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄層析圖，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，相似度＞0.95，表明儀器精密度良好;③重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品(1號(hào)樣品)5份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品并進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，相似度＞0.95，表明重現(xiàn)性良好;④穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液(1 號(hào)樣品)，分別在0、2、4、6、8、12、24h 進(jìn)樣，記錄層析圖，經(jīng)中藥層析指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，相似度＞0.95，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序(%)

圖1 延胡索乙素的層析圖

結(jié) 果

1.指紋圖譜的測(cè)定:13批延胡索藥材按上述實(shí)驗(yàn)方法制成供試品溶液，在上述層析條件下，分別進(jìn)樣并記錄108min層析圖。

2.共有峰的標(biāo)定:108min內(nèi)共有23個(gè)主要特征峰，且均為共有峰，2號(hào)樣品的層析圖見(jiàn)圖2。13批延胡索藥材指紋圖譜匹配后的圖譜見(jiàn)圖3。其中19號(hào)峰為延胡索乙素，由于14號(hào)峰含量最高且比較穩(wěn)定，故將其作為參比峰(S)，計(jì)算其他各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。13批延胡索藥材層析圖中非共有峰面積占總峰面積的百分比＜6%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

3.相似度評(píng)價(jià):運(yùn)用“中藥層析指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”軟件，計(jì)算13批延胡索藥材的相似度，結(jié)果見(jiàn)表5。除13號(hào)延胡索藥材的相似度為0.926外，其余12批樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜的相似度均＞0.95。

表2 元胡藥材HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 元胡藥材HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

表4 13批元胡藥材生品相似度結(jié)果

討 論

1.提取溶劑的選擇:分別用濃氨∶甲醇(1∶20)，濃氨∶乙醇(1∶20)，濃氨∶50%甲醇(1∶20)3 種提取溶劑對(duì)供試品進(jìn)行提取。經(jīng)比較，當(dāng)提取溶劑為濃氨∶甲醇(1∶20)時(shí)，層析圖顯示層析峰數(shù)較多且層析峰較高，所以選擇濃氨∶甲醇(1∶20)為提取溶劑。

2.層析柱的選擇:層析柱比較了 YMC－Pack ODS －A(250.0mm ×4.6mm，粒徑5.0μm)和 Thermo hypersil GOLD C18(250.0mm ×4.6mm，粒徑 5.0μm)的分離效果，選擇Thermo hypersil GOLD C18柱。

3.流動(dòng)相的選擇:流動(dòng)相A相分別選擇甲醇和乙腈，相同洗脫梯度程序下，經(jīng)比較，流動(dòng)相A相為甲醇時(shí)，層析峰分離度良好。流動(dòng)相B相pH值分別選擇 4.0、5.0、6.0，經(jīng)比較，當(dāng) pH 值為 5.0 時(shí)，層析峰形及分離度較好，所以B相pH值選擇5.0。

4.檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器，在190～400nm波長(zhǎng)檢測(cè)，得到三維光譜圖。結(jié)果顯示280nm層析峰形較好，出峰數(shù)目較多，各層析峰之間分離度較好，故選擇280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5.相似度評(píng)價(jià):從表5相似度結(jié)果來(lái)看，13批延胡索藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，除13號(hào)樣品外，其余都高于0.95，表明該13批延胡索樣品的共有特征峰基本保留，相似度良好。

本實(shí)驗(yàn)建立了延胡索藥材的HPLC指紋譜的測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，得到延胡索藥材HPLC指紋圖譜及相關(guān)數(shù)據(jù)，為延胡索藥材及其他含延胡索的中藥復(fù)方制劑制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:130

2 浙江植物志編輯委員會(huì).浙江植物志(總論)［M］.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1993:256

3 賀凱，高建莉，趙光樹(shù).延胡索化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.中草藥，2007，38(12):1909－1912

4 謝培山.中藥色譜指紋圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:10

5 周玉新，等.中藥指紋圖譜研究技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:131

6 竇志英，孫巍，張敏，等.陜西產(chǎn)延胡索藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26(3):150－153

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9 施菁，王煒，陳柳蓉.白花土元胡藥材的高效液相色譜法指紋圖譜研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27(9):1108－1110

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11 程星燁，石鉞.延胡索抗心肌缺血活性部位指紋圖譜中化學(xué)成分分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(14):1717－1719