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        大孔吸附樹脂純化山藥總皂苷的工藝研究

        2011-07-25 10:27:28陳曉輝畢開順
        中成藥 2011年10期
        關(guān)鍵詞:粗提物總皂苷大孔

        平 靜, 李 清, 陳曉輝, 畢開順

        (沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,遼寧沈陽110016)

        山藥Dioscoreae Rhizoma為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thumb的干燥根莖,收載于《中國藥典》2010年版一部,但其項(xiàng)下僅有性狀、鑒別和炮制等項(xiàng)目[1]。山藥藥性甘平,歸脾、肺、腎經(jīng)。具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精之功效,化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸類化合物、多糖類化合物、微量元素、皂苷類化合物[2-4]。目前國內(nèi)外對山藥的研究以多糖為主要研究對象,而對其皂苷類成分研究報道很少[5-7],迄今為止尚無對山藥總皂苷的純化工藝研究報道。皂苷類化合物主要含有薯蕷皂苷(dioscin)、原屬于皂苷(protodioscin),現(xiàn)代研究證實(shí)其抗腫瘤、抗炎、心血管保護(hù)等活性顯著,具有很高的藥用價值[8-12]。因此,富集純化皂苷類化合物具有廣泛意義。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化山藥總皂苷大孔吸附樹脂純化工藝研究,為山藥資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        UV-265FW紫外可見分光光度計(日本島津公司);HY-4調(diào)速多用振蕩器(大地自動化儀器廠);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

        山藥飲片(河南省焦作市中藥材飲片廠,經(jīng)沈陽藥科大學(xué)賈英副教授鑒定為正品);薯蕷皂苷對照品(實(shí)驗(yàn)室自制,純度 >98%);大孔吸附樹脂 AB-8,HPD100,HPD300,HPD600(滄州寶恩化工有限公司)和D101(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);水為重蒸水,無水乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 山藥總皂苷UV-VIS分光光度法測定方法的建立 取薯蕷皂苷對照品10 mg,精密稱定,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液。精密量取對照品溶液1 mL置具塞試管中,揮干溶劑,精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液 0.2 mL,高氯酸0.8 mL,加塞,于60℃水浴中反應(yīng)15 min,取出,冷卻至室溫,精密加入冰乙酸5.0 mL,搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,采用島津UV-265FW紫外可見分光光度計在455 nm波長下測定吸光度。精密量取對照品溶液 0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL,分別置具塞試管中,按相同方法處理后,在455 nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),質(zhì)量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為y=2.964 x+0.0155,r=0.9997,線性范圍為 0.0612 ~0.3060 mg。

        2.2 山藥乙醇粗提物的制備 稱取山藥飲片粉末(過40目篩)200 g,用30倍體積60%乙醇回流提取3次,每次2 h,過濾殘渣,合并濾液,蒸干溶劑,制備成山藥乙醇粗提物,干燥保存,用于以下工藝研究。

        式中:C0為吸附前溶液中皂苷初始質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液中皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL);C2為解吸液中皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)。

        表1 不同型號大孔吸附樹脂對總皂苷的吸附解吸性能

        由表1可知,AB-8的吸附率最高,HPD600的解吸率最高,AB-8次之,然而HPD600的吸附率最低,綜合考慮,采用AB-8大孔吸附樹脂純化山藥總皂苷。

        2.4 AB-8大孔吸附樹脂上樣吸附時間的考察 分別準(zhǔn)確稱取0.5 g預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂置于6個100 mL三角瓶中,分別加入含山藥總皂苷1 mg的粗提物水溶液,靜置 0.5、1、2、4、6、8 h。測定吸附后的皂苷質(zhì)量濃度,計算吸附率。見圖1。

        如圖1所示,吸附時間達(dá)4 h前,山藥總皂苷的吸附率明顯提高,而4 h之后則無明顯增加,因此,上樣吸附時間確定為4 h。

        2.5 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)吸附量的考察 山藥總皂苷樣品液(0.1176 mg/mL)按體積流量1.5 BV/h不斷加入到預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱,柱體積為40 mL,每10 mL收集1個流份,測定每個流份中山藥總皂苷的量,繪制動態(tài)泄漏曲線。見圖2。

        圖1 AB-8大孔吸附樹脂上樣吸附時間的考察

        圖2 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)吸附量的考察

        如圖2所示,隨著上樣量的增加,流出液中總皂苷的量也隨之增加,當(dāng)加樣量達(dá)到200 mL時,即總皂苷加入23.52 mg時,流出液中總皂苷量達(dá)到穩(wěn)定,即大孔樹脂動態(tài)吸附達(dá)到飽和,繼續(xù)上樣會導(dǎo)致總皂苷隨流出液流出而損失,由此確定動態(tài)最大上樣量。

        2.6 AB-8大孔吸附樹脂上樣質(zhì)量濃度的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂濕法裝柱,柱體積為40 mL,分別加入山藥總皂苷質(zhì)量濃度為2、4、6、8 mg/mL的粗提物水溶液(總上樣量為20 mg),上樣吸附時間為4 h,分別測定流出液中總皂苷質(zhì)量濃度,計算吸附率。見圖3。

        圖3 AB-8大孔吸附樹脂上樣質(zhì)量濃度的考察

        如圖3所示,隨著上樣質(zhì)量濃度的增加,樹脂對山藥總皂苷的吸附能力有所下降,當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為4 mg/mL時吸附率最高,因此,上樣質(zhì)量濃度確定為4 mg/mL。

        2.7 AB-8大孔吸附樹脂洗脫溶劑的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂濕法裝柱,柱體積為40 mL,加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液,上樣吸附時間為4 h,依次用蒸餾水,15%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液各4 BV洗脫,每個濃度收集為一個流份,分別測定各洗脫流份中總皂苷的質(zhì)量。見表2。

        表2 AB-8大孔吸附樹脂洗脫溶劑的考察 (n=3)

        由表2可知,水和15%乙醇幾乎不能把山藥總皂苷洗脫下來,30%,50%,70%乙醇對于山藥總皂苷均有一定的洗脫能力,其中50%的乙醇洗脫能力最強(qiáng),而且把皂苷基本洗脫完全。因此,確定首先以水和15%乙醇洗去雜質(zhì),再以50%乙醇進(jìn)行洗脫。

        2.8 AB-8大孔吸附樹脂洗脫體積的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂濕法裝柱,柱體積為40 mL,加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液,上樣吸附時間為4 h,先用蒸餾水洗至無色,再用15%乙醇洗去雜質(zhì),然后用50%乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫液每40 mL(一個柱體積)為一個收集單位,至流出液無皂苷反應(yīng),分別測定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見表3。

        表3 AB-8大孔吸附樹脂洗脫體積的考察 (n=3)

        由表3可知,5 BV即可將皂苷洗脫完全,因此,確定洗脫體積為5 BV。

        2.9 AB-8大孔吸附樹脂洗脫體積流量的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂濕法裝柱,柱體積為40 mL,加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液,上樣吸附時間為4 h,先用蒸餾水洗至無色,再用15%乙醇出去雜質(zhì),然后用50%乙醇洗脫5 BV,洗脫體積流量分別為 1.5、3、5、7 BV/h,收集洗脫液,分別測定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見圖4。

        圖4 AB-8大孔吸附樹脂洗脫體積流量的考察

        由圖4可知,隨著洗脫流速的增加,解吸率有明顯降低,因此,增加流速并不能提高山藥總皂苷的解吸效率,應(yīng)選擇1.5BV/h 較為適宜。

        2.10 AB-8大孔吸附樹脂上樣pH值的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂濕法裝柱,柱體積為40 mL,加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液,上樣pH分別為4,7,9,上樣吸附時間為4 h,先用蒸餾水洗至無色,再用15%乙醇除去雜質(zhì),然后用50%乙醇洗脫5 BV,洗脫體積流量為1.5 BV/h,收集洗脫液,分別測定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見圖5。

        圖5 AB-8大孔吸附樹脂上樣pH值的考察

        由圖5可知,上樣pH對吸附率的影響并不明顯,考慮操作簡便,節(jié)省成本,山藥總皂苷的上樣pH值選為7。

        2.11 驗(yàn)證試驗(yàn) 按以上工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表4。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行,總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到52.1%。

        表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

        3 討論

        3.1 山藥中皂苷多為甾體皂苷,由非極性的甾體苷元和極性的糖基組成,整個分子顯示強(qiáng)極性,而在水溶液中苷元部分可通過疏水作用與樹脂的疏水表面相吸附。因此,皂苷類既可以被非極性樹脂吸附,也可以被極性的樹脂吸附。本試驗(yàn)結(jié)果表明,弱極性樹脂對山藥中皂苷的吸附較強(qiáng)。

        4.2 本試驗(yàn)通過對大孔吸附樹脂純化山藥總皂苷工藝的研究,確定純化工藝為:采用AB-8型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化,上樣pH為7,上樣吸附時間為4 h,上樣質(zhì)量濃度為4 mg/mL,洗脫體積流量為1.5 BV/h,經(jīng)水和15%乙醇除去雜質(zhì),然后用50%乙醇洗脫5 BV。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,在該工藝下,總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)50%以上。

        4.3 中藥成分較復(fù)雜,通過現(xiàn)代中藥純化技術(shù),可使中藥提取物的純度提高,從而提高療效,降低不良反應(yīng)。大孔吸附樹脂法純化中藥,為進(jìn)一步成型工藝及質(zhì)量控制提供便利形式。本試驗(yàn)采用AB-8大孔吸附樹脂純化山藥總皂苷吸附效果好、解吸附條件溫和,使有效成分高度富集,穩(wěn)定性好,受pH、溫度和其他因素影響小,容易再生、可以多次反復(fù)使用,具有較廣闊的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。

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