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        分析精液蛋白激酶A與男性不育患者精液參數(shù)及精子形態(tài)的關(guān)系

        2011-07-25 10:20:26陳鵬勛
        亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2011年12期
        關(guān)鍵詞:精液磷酸化精子

        陳鵬勛

        (鄭州人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,河南 鄭州 450000)

        蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)普遍存在于真核細(xì)胞,介導(dǎo)跨膜信號(hào)的信號(hào)傳導(dǎo),其作用于各種與糖脂代謝相關(guān)的酶類。PKA是精子蛋白酪氨酸磷酸化限速酶,參與精子運(yùn)動(dòng)力、精子超激活運(yùn)動(dòng)、精子獲能等多種生理生化過程。有研究表明PKA在調(diào)節(jié)精子活力方面起主要作用,可能影響精子形態(tài),而精子活力和精子形態(tài)影響精子的功能從而直接關(guān)系到男性的生育能力。目前,有關(guān)精液PKA含量與男性不育患者精液主要參數(shù)及精子形態(tài)的相關(guān)性研究較少,且確切關(guān)系仍有爭(zhēng)議。本研究通過對(duì)比不同精子活力和精子形態(tài)男性不育患者精液PKA含量,來探討精液PKA含量與男性不育患者精液活力及精子形態(tài)的關(guān)系,以期為男性不育的臨床診斷和治療提供新的思路和方法。

        1 材料與方法

        1.1 一般資料

        選取2010年2月-2011年6月我院診治的男性不育患者300例,年齡25~38歲,平均(31.3±3.2)歲,不育年限1~7年,平均(4.0±1.4)年。納入標(biāo)準(zhǔn):夫婦雙方性生活正常,婚后未避孕1年以上未孕,女方檢查無(wú)明顯異常,男方無(wú)明顯睪丸、附睪及輸精管異常,無(wú)性功能障礙史,無(wú)外傷及家族遺傳性病史,無(wú)不良生活習(xí)慣(如煙酒等嗜好);排除染色體檢查異常者。

        1.2 方法

        (1)精液采集與分析:禁欲3~7天,在實(shí)驗(yàn)室手淫法留取全部精液,置于清潔干燥的取精杯中,37℃水浴待液化后進(jìn)行精液常規(guī)分析,分析系統(tǒng)采用WLJY9000彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)。按第四版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》精液參數(shù)檢測(cè)方法檢測(cè)。

        (2)精液PKA含量的測(cè)定:取出酶標(biāo)板,按序在空白微孔中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)記樣本后加50μL樣本至空白微孔中。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中各加入50μL酶標(biāo)記溶液,37℃孵育60min,洗板機(jī)清洗5次,靜置10~20s。每孔加入底物呈色劑A液和B液各50μL,37℃下避光孵育15min,后加入50μL終止液終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度值(A)。B=標(biāo)準(zhǔn)品A值,BO=標(biāo)準(zhǔn)品O點(diǎn)A值,以B/BO%值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(線性范圍1~100ng/mL)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍。試劑盒敏感性為1.0ng/mL。

        (3)改良巴氏染色:標(biāo)本置于95%乙醇溶液固定5~15min,按WHO推薦的改良巴氏染色法染色、脫水、透明和封片,按Kruger等標(biāo)準(zhǔn)油鏡下每張涂片觀察200個(gè)以上精子(只觀察有尾部的可辨認(rèn)完整精子),計(jì)錄正常和畸形精子。

        (4)參數(shù)記錄和比較:記錄患者年齡、不育年限、精液量、液化時(shí)間、精子密度、精子活力、PKA含量。根據(jù)精子活力將患者分為活力正常組(a+b級(jí)精子≥50%)、輕度弱精組(25%<a+b級(jí)精子<50%)和重度弱精組(a+b級(jí)精子<25%);另根據(jù)精液形態(tài)檢測(cè)結(jié)果,將患者分為形態(tài)正常組(正常形態(tài)精子≥14%)和形態(tài)異常組(正常形態(tài)精子<14%)。比較各組相關(guān)參數(shù)差異。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較

        不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較見表1。與活力正常組相比,輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輕度弱精組PKA含量明顯降低重度弱精組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較()

        表1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較()

        注:*P<0.05,與活力正常組比較;#P<0.05,與輕度弱精組比較。

        活力正常組(n=114)輕度弱精組(n=98)重度弱精組(n=88)30.7±2.7 31.2±3.0 32.2±3.4不育年限(年) 3.8±1.3 4.0±1.5 4.1±1.7精液量(mL) 2.5±0.79 2.4±0.81 2.4±0.78液化時(shí)間(min) 40.6±12.5 35.8±12.8 34.6±12.4密度(×106/mL) 76.6±21.6 68.2±23.9 67.6±13.9 PKA含量(ng/mL) 66.9±9.67 58.3±8.89* 45.1±8.67*#年齡(歲)

        2.2 精子形態(tài)正常組和形態(tài)異常組相關(guān)參數(shù)比較

        精子形態(tài)正常組和形態(tài)異常組相關(guān)參數(shù)比較見表2。與精子形態(tài)正常組相比,形態(tài)異常組的PKA含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表2 正常形態(tài)組和異常形態(tài)組相關(guān)參數(shù)比較()

        表2 正常形態(tài)組和異常形態(tài)組相關(guān)參數(shù)比較()

        注:*P<0.05,與正常組比較。

        正常組(n=147) 異常組(n=153)30.7±5.7 31.9±5.3不育年限(年) 4.58±2.8 4.32±2.9精液量(mL) 2.7±0.77 2.5±0.71液化時(shí)間(min) 39.6±11.5 36.8±12.5 PKA含量(ng/mL) 65.6±8.63 47.2±7.98*年齡(歲)

        3 討論

        3.1 PKA的作用基礎(chǔ)

        PKA又稱為依賴于cAMP的蛋白激酶A,活化的PKA可作用于各種與糖脂代謝相關(guān)的酶類,一些離子通道和某些轉(zhuǎn)錄因子,使它們發(fā)生磷酸化并改變其狀態(tài)。而精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子運(yùn)動(dòng)力、精子超激活運(yùn)動(dòng)、精子獲能等多種生理生化過程的重要調(diào)控因素。表明PKA在調(diào)節(jié)精子活力方面起主要作用。

        另有研究表明AKAP為調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)力的支架蛋白,在獲能過程中AKAP3發(fā)生酪氨酸磷酸化將增加與PKA結(jié)合的蛋白,使得PKA在特異細(xì)胞結(jié)構(gòu)中被募集與激活,最終提高精子運(yùn)動(dòng)力。

        3.2 PKA含量與精子活力之間的關(guān)系

        關(guān)于PKA含量與精子活力之間的研究比較多,認(rèn)為PKA含量可以直接影響精子活力。本文也得出了一致的結(jié)論,與活力正常組相比,輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是通過調(diào)節(jié)精子尾部動(dòng)力蛋白表面的亞基磷酸化或通過cAMP/PKA途徑調(diào)整精子活力。

        3.3 PKA含量與精子形態(tài)之間的關(guān)系

        精子形態(tài)分析一直是男性不育研究的熱點(diǎn),因?yàn)榫有螒B(tài)直接關(guān)系精子的功能和受精能力。關(guān)于PKA的研究一直較多集中在PKA的作用機(jī)理以及它對(duì)精子活力的影響,較少見到PKA在精子形態(tài)方面的研究。本文比較不同精子形態(tài)下的PKA含量發(fā)現(xiàn),與精子形態(tài)正常組相比,形態(tài)異常組的PKA含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PKA與精子形態(tài)關(guān)系密切,可能通過某種途徑影響精子的發(fā)育和成熟,說明PKA不僅影響精子活力,也可以影響精子形態(tài)。關(guān)于其深層次的機(jī)制問題尚需進(jìn)一步的研究。

        綜上所述,PKA含量與精子活力關(guān)系密切,并影響精子形態(tài),其確切的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

        [1]YU JJ,XU YM.U1trastructural defects of acrosome in infertile men[J].Arch Androl,2004,50(6):405-409.

        [2]谷翊群,陳振文,于和鳴.WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)第四版[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

        [3]KRUGER TF,ACOSTA AA,SIMMONS KF,et a1.Predictive valueof abnormal sperm morphology in in vitro fertilization[J].Fertil Steril,1988,49(1):112-117.

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