貝 煜，于 洋，黎同明

（廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

五味子為木蘭科植物Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”，性溫，味酸、甘，為常用收澀藥，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，用于久咳虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥狀。五味子的主要活性成分為木脂素類，如五味子醇甲（schisandrol A）、五味子酯甲（Schisantherin A）、五味子甲素（schisandrin A）和五味子乙素（schisandrin B）等［1］?，F(xiàn)代研究表明，五味子主要活性成分具有顯著的保肝作用及逆轉(zhuǎn)P－gp所介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥性。雖然對其藥代動力學(xué)研究的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很多，但是對五味子木脂素的在體腸吸收機(jī)制研究鮮見報(bào)道。本文以北五味子為模型藥物，以主要活性成分五味子醇甲，甲素、乙素、酯甲為研究對象，建立適用于五味子木脂素吸收研究的大鼠原位灌注模型、研究五味子木脂素在不同濃度下以及在P－gp抑制劑共同作用下的吸收差異。為今后五味子口服制劑的研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

HL－2恒流蠕動泵（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；島津LC－2010C型高效液相色譜儀，SPD－M10AVP型二極管陣列檢測器，Shimadzu’LC solution色譜工作站（日本島津公司）；722s可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品及試劑

五味子藥材（廣州致信中藥飲片有限公司，批號：091020，產(chǎn)地：吉林）；五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110857－201010）；五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111529－200503）；五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110764－201010）；五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110765－200710）；維拉帕米（上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠）；水合氯醛（天津百世化工有限公司）；酚紅（天津市化學(xué)試劑研究所）。甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析醇。

1.3 動物

SD大鼠，體重（250±30）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 五味子醇提物的制備

取五味子藥材干燥粉碎，過65目篩，得五味子粉末。精密稱取五味子粉末100g，用10倍量60%的乙醇加熱回流提取兩次，每次1h。合并提取液，靜置過濾，減壓回收乙醇，真空干燥后備用。

2.2 溶液的配制

Krebs－Ringer，s（K－R）：稱取 NaCl 7.8g，KCl 0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH3PO40.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，蒸餾水定容至1L，即得到pH7.4的KR液?？瞻籽h(huán)液：K－R液進(jìn)行大鼠腸循環(huán)灌注3h，即得。酚紅K－R液：精密稱取酚紅20mg，置1000mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到濃度為20μg·mL－1的酚紅 K－R液。

2.3 大鼠原位腸循環(huán)灌注模型的建立［2］

取實(shí)驗(yàn)前禁食12h（自由飲水）的SD大鼠，腹腔注射水合氯醛0.35mL·100g－1，麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔（約2.5cm），結(jié)扎膽總管，在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管兩端各切一小口，在上端小口處插入直徑為0.3cm的玻璃管，并用線扎緊。用注射器將（37±0.5）℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內(nèi)容物至凈。然后在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管下端小口處插入玻璃管，并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵的膠管連接，形成回路，開動蠕動泵。以5mL·min－1流速循環(huán)10min后，將流速調(diào)節(jié)為2.5mL·min－1，立即自裝有灌注液的錐形瓶中取樣1mL，作為測定零時(shí)間藥物濃度和酚紅濃度的樣品，另向錐形瓶中補(bǔ)加酚紅K－R液lmL，其后每隔20min亦按同法取樣并補(bǔ)加酚紅K－R液，循環(huán)3h后，中止實(shí)驗(yàn)。

2.4 原位腸灌注實(shí)驗(yàn)法中參數(shù)計(jì)算［3］

吸收速率常數(shù)（Ka）：以小腸內(nèi)剩余藥量的對數(shù)（lnX）對取樣時(shí)間t作圖，得到一直線，從直線斜率可求吸收速率常數(shù)Ka（h－1）：Ka＝（InX0－InX）／t。表現(xiàn)滲透系數(shù)Papp：藥物透過胃腸道粘膜的表觀滲透系數(shù)Papp，單位為cm·s－1。A為小腸吸收面積（cm2）。Papp＝Ka／A／3600。

2.5 灌流液中酚紅濃度的測定

由于腸灌流的過程中不但有水的吸收，還有水的分泌，導(dǎo)致循環(huán)液的體積發(fā)生變化，通過對酚紅濃度的測定來校正水的吸收。用空白腸灌流液加入酚紅配制濃度為10.2、20.4、40.8、61.2和81.6μg·mL－1等一系列標(biāo)準(zhǔn)液，取上述不同濃度的酚紅溶液各0.5mL，加入4.5mL 1.0mol·L－1的NaOH溶液顯色，于400～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在558nm處酚紅有最大吸收，因此于558nm處測定酚紅的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)（Y）、酚紅濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 灌流液中五味子4種有效成分濃度的測定

色譜條件：色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；Phenomenex C18預(yù)柱；流動相：A 為甲醇，C為水（65∶35v／v）；梯度洗脫：0～40min，65%～90%，40～45min，90%～65%；45～50min，A為65%，C為35%；流速為1mL·min－1，柱溫為35℃，檢測波長為235nm，進(jìn)樣量為50μL。對照品溶液的制備：分別精密稱取五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素對照品0.00220g，0.00159g，0.00126g，0.00145g，置于100mL容量瓶中，加入酚紅 K－R液－甲醇（1∶1，V／V），定容至刻度。得到混合對照品溶液。供試液的制備：精密稱取五味子醇提物干膏1g，置于錐形瓶中，加入2.5mL DMSO和2.5mL無水乙醇超聲溶解，得到五味子醇體液儲備液。分別取五味子醇體液儲備液0.5mL，1mL和2mL，置于容量瓶中，加入酚紅 K－R液，超聲溶解，并稀釋定容到刻度，搖勻，使五味子醇提物的濃度為1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1。樣品的處理：精密吸取腸灌流液0.5mL，加0.5mL甲醇，渦旋混合1min，過0.45μm微孔濾膜。在上述色譜條件下進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素混合對照品儲備液適量，按倍數(shù)稀釋法，用K－R溶液：甲醇（1∶1，V／V）溶液稀釋，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.7.1 五味子4種有效成分在K－R液中的穩(wěn)定性考察

用空白腸灌流液配制濃度為2mg·mL－1的五味子醇提取物，置于密閉容器中，37℃水浴3h，分別于0、1、2、3h取樣，測定五味子醇提取物中4種有效成分的含量，并計(jì)算其剩余百分率（）。

2.7.2 五味子4種有效成分在不同pH值K－R液中的穩(wěn)定性考察

用1.0mol·L－1HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)空白K－R液到不同的pH值分別為5.01、6.84和7.97.然后分別用這3種pH值的K－R液配制濃度為2mg·mL－1的五味子醇提取物作為供試液，置于密閉容器中，于37℃水浴中放置3h，分別于0、1、2、3h取樣測定五味子提取物中4種有效成分的濃度，并計(jì)算其剩余百分率（）。

2.8 五味子總木脂素不同劑量組大鼠的吸收研究

用酚紅 K－R液分別配制濃度為1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1五味子醇提物作為供試品溶液。取SD大鼠15只，隨機(jī)分成三組，按照“2.1”的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，結(jié)扎膽管后，自十二指腸上部及回盲腸末端插管，分別用供試液1、2、3進(jìn)行原位腸循環(huán)灌注，定時(shí)取樣，測定各時(shí)間點(diǎn)的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的濃度，然后按照“2.4”計(jì)算其 Ka、Papp。

2.9 P－gp抑制劑對五味子總木脂素腸吸收機(jī)理和吸收調(diào)控的研究

用酚紅K－R液分別配置濃度為2mg·mL－1五味子醇提物作為對照組溶液，加入維拉帕米（0.1mg·mL－1）作為供試品溶液。取SD大鼠15只，隨機(jī)分成三組，分別考察小腸的吸收。按照“2.3”的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作進(jìn)行原位腸循環(huán)灌注，定時(shí)取樣，測定各時(shí)間點(diǎn)的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的濃度，然后按照“2.4”計(jì)算其 Ka、Papp。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 灌流液中酚紅濃度的測定

以吸光度A與酚紅濃度C（μg·mL－1）進(jìn)行線性回歸，得酚紅測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝0.0162X＋0.0255，r＝0.9999（n＝5），線性范圍為10.20～81.6μg·mL－1，RSD為0.68%，平均回收率為100.1%。

3.2 灌流液中五味子4種有效成分濃度的測定

圖1 腸灌流液中4種有效成分的HPLC色譜

五味子醇甲：Y＝201524X＋33188，r＝0.9997，線性范圍為0.088～22.000μg.mL－1；五味子酯甲：Y＝318516X＋14207，r＝0.9998，線性范圍為0.064～15.900μg.mL－1；五味子甲素：Y＝223174X＋10514，r＝0.9998，線性范圍為0.050～12.600μg.mL－1；五味子乙素：Y＝ 203827X＋6826.2，r＝0.9998，線性范圍為0.029～14.500μg.mL－1。五味子醇甲、酯甲、甲素、乙素的平均回收率分別為（100.56±2.08）%、（99.03±1.78）%、（100.59±1.49）%和（98.28±1.42）%，RSD分別為為2.06%、1.80%、1.48%和1.44%。以上結(jié)果表明，五味子木脂素4種有效成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系并具有較好的回收率。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3.3.1 五味子4種有效成分在K－R液中的穩(wěn)定性考察

濃度為1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1的五味子提取物在空白大鼠腸灌流液中的穩(wěn)定性見表1，結(jié)果顯示，高、中、低3個濃度的五味子提取物中4種有效成分在空白腸灌流液中3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表1 五味子4種有效成分在37℃灌流液中的穩(wěn)定性（n＝3，）

表1 五味子4種有效成分在37℃灌流液中的穩(wěn)定性（n＝3，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高劑量組 99.57±0.8199.17±1.63101.67±1.67100.01±1.65中劑量組 99.09±0.9199.67±0.77101.10±1.17101.10±1.91低劑量組 99.82±1.55101.96±1.47100.37±0.9799.33±0.82

3.3.2 五味子4種有效成分在不同pH值K－R液中的穩(wěn)定性考察

表2 五味子4種有效成分在不同pH值灌流液中的穩(wěn)定性（n＝3，）

表2 五味子4種有效成分在不同pH值灌流液中的穩(wěn)定性（n＝3，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素5.0199.27±1.2698.00±2.0498.46±1.5699.47±0.566.4899.38±0.6998.32±1.4298.37±1.5199.27±0.627.9799.24±0.5498.80±2.15100.90±0.79100.42±0.64

濃度為2mg·mL－1的五味子提取物在不同pH值的空白大鼠腸灌流液中的穩(wěn)定性見表2，結(jié)果顯示，五味子提取物中4種有效成分在pH值為5.01～7.79范圍內(nèi)的空白腸灌流液中3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 五味子總木脂素不同劑量組大鼠的吸收研究

表3 五味子高中低劑量組灌流液中4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

表3 五味子高中低劑量組灌流液中4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高劑量組 Ka 0.137±0.018 0.297±0.034 0.458±0.087 0.47 S 0.174中劑量組 Ka 0.126±0.032 0.303±0.092 0.449±0.080 0.396±0.031 Papp×10－6cm·sec－1 0.317±0.079 0.766±0.233 1.133±0.203 1.169±0.203低劑量組 Ka 0.127±0.035 0.284±0.081 0.438±0.188 0.390±0.043 Papp×10－6cm·sec－1 0.319±0.088 0.717±0.206 1.107±0.048 1.086±0.1089±0.069 Papp×10－6cm·sec－1 0.344±0.045 0.751±0.085 1.156±0.219 1.210±

3.5 P－gp抑制劑對五味子總木脂素腸吸收研究

表4 P－gp抑制劑后五味子4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

表4 P－gp抑制劑后五味子4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

注：＊P＜0.05vs control of Ka；△P＜0.05vs control of Papp。

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素維拉帕米 Ka 0.143±0.022 0.434±0.126＊ 0.437±0.035＊ 0.429±0.014＊Papp×10－6cm·sec－1 0.340±0.055 1.097±0.318△ 1.106±0.088△ 1.081±0.033△0.083對照組 Ka 0.166±0.035 0.310±0.074 0.336±0.031 0.363±0.024 Papp×10－6cm·sec－1 0.420±0.088 0.784±0.187 0.879±0.097 0.929±

由以上各表可知，五味子4種有效成分，在考察的濃度范圍以內(nèi)，濃度增加一倍，吸收速率（Ka）和表觀滲透系數(shù)（Papp）卻沒有顯著性差異（P＞0.05），并不符合Fick s方程。這提示在所考察的濃度范圍內(nèi)五味子4種有效成分不只是單純的被動擴(kuò)散，而是存在載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)方式。加入P－gp抑制劑維拉帕米（VP）與正常組相比，五味子酯甲、甲素和乙素這三種有效成分的吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀滲透系數(shù)（Papp）都顯著增加（P＜0.05）。這種促進(jìn)吸收的效果是通過抑制P－gp的外排而起作用的，提示五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素是P－gp的底物。

4 討論

藥物的口服吸收是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，其中透膜過程是關(guān)鍵。藥物透膜過程主要有三種機(jī)制：被動轉(zhuǎn)運(yùn)（passive transport）、載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)（carrier－mediated transport）和膜動轉(zhuǎn)運(yùn)（Membrane mobile transport）。藥物在體內(nèi)的吸收大多數(shù)是在小腸中進(jìn)行的，從不同劑量組對五味子總木脂素吸收影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，在考察的濃度范圍以內(nèi)五味子4種有效成分并沒有體現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，轉(zhuǎn)運(yùn)過程不符合Ficks擴(kuò)散定律，說明五味子在考察的濃度范圍內(nèi)可能是屬于載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)。載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)是：①需要消耗機(jī)體能量，能量來源主要由機(jī)體細(xì)胞代謝產(chǎn)生的ATP提供；②需要載體的參與，載體往往是細(xì)胞膜上的膜蛋白或者是標(biāo)志酶，與藥物本身有較高的選擇性；③主動轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率和轉(zhuǎn)運(yùn)量與載體的量及其活性有關(guān)，當(dāng)藥物濃度較低的時(shí)候，載體的量和活性相對較高，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)速率快。當(dāng)藥物濃度逐漸升高時(shí)，載體趨于飽和，轉(zhuǎn)運(yùn)速率減慢，甚至轉(zhuǎn)運(yùn)飽和，加上結(jié)構(gòu)相似的化合物之間相互競爭載體結(jié)合位點(diǎn)而影響轉(zhuǎn)運(yùn)。五味子總木脂素4種有效成分高中低三個濃度可能處在載體濃度飽和階段，加上4種組分基本構(gòu)架相似，產(chǎn)生競爭結(jié)合的現(xiàn)象，因而當(dāng)濃度加倍增加，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速率并沒有明顯的提高。

多藥耐藥（MDR）是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的最重要的防御機(jī)制。MDR是由一種藥物誘發(fā)的、對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象，是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，是提高化療療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，五味子乙素對P－糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞 MDR有明確的逆轉(zhuǎn)效果［4］。李玲等［5］研究證實(shí)五味子乙素具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）介導(dǎo)的白血病多藥耐藥細(xì)胞株 HL－60／ADR，HL－60／MRP耐藥的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道［6－9］，五味子粗提物及其有效成分五味予甲素逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果很明顯。在與抗腫瘤藥物長青新堿、紫杉醇、阿霉素合用對抑制小鼠肉瘤S180生長的增強(qiáng)作用實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，五味子粗提物與這3種藥物合用后，三藥抑瘤作用均有一定程度的增強(qiáng)，抑瘤率分別達(dá)到51.66%、38.11%和53.05%。在機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)：①五味子能增加抗腫瘤藥在耐藥腫瘤細(xì)胞中的蓄積，從而增強(qiáng)其療效；②能夠抑制P－糖蛋白的表達(dá)，提示至少部分通過直接或間接地干擾P－糖蛋白介導(dǎo)的藥物而發(fā)揮其作用；③能顯著增加阿霉素誘導(dǎo)肝癌BEL 7402細(xì)胞發(fā)生凋亡的易感性：④鈣拮抗劑VER能部分拮抗二氫吡啶類鈣激動劑BAYK8644介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加，提示五味子甲素本身無鈣拮抗活性。近年來，天然藥物的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂和抗菌消炎等藥理作用成為研究的熱點(diǎn)，而五味子木脂素的這一發(fā)現(xiàn)無疑讓五味子在腫瘤藥物的研發(fā)領(lǐng)域中占據(jù)了重要的位置，為天然藥物抗腫瘤提供了新的思路和新的方向。

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